Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Вирус гриппа. Общие сведения 10
1.1.1 Строение вириона 10
1.1.2 Жизненный цикл вируса гриппа 10
1.2. Белки вируса гриппа 12
1.2.1 Белки полимеразного комплекса (РВ2, РВ1, РА) 12
1.2.2 Поверхностные белки вируса гриппа- гемагглютинин и нейраминидаза 12
1.2.3 Нуклеопротеин (NP) 19
1.2.4 Ml и М2 белки 20
1.2.5 Неструктурные белки 20
1.3 Специфический иммунитет к вирусу гриппа и ЖГВ 21
1.3.1 Гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа и ЖГВ 22
1.3.2 Клеточный иммунный ответ к вирусам гриппа и ЖГВ 24
1.3.3 Методы оценки гуморального иммунного ответа на гриппозную инфекцию 25
1.3.4 Морская свинка как модель для изучения противогриппозного иммунитета 28
1.4 Свойства вируса гриппа, которые могут повлиять на иммуногенность гриппозных
вакцин 30
1.4.1 Температурочувствительность «диких» вирусов, ее возможные механизмы 31
1.4.2 Влияние ts-фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины 32
1.4.3 Ингибиторочувствительность «диких» вирусов, ее природа и возможные механизмы 34
1.4.4 Связь ингибиторочувствительности с иммуногенностью 37
1.4.5 Связь рецепторной специфичности с иммуногенностью 39
1.5 Кодонная оптимизация как способ повышения иммуногенности 43
1.5.1 Теоретические основы оптимизации кодонного состава 43
1.5.2 Использование метода изменения кодонного состава в разработке аттенуированных противовирусных вакцин 45
1.5.3 Повышение иммуногенности противовирусных вакцин путем оптимизации кодонного состава 47
1.6 Заключение к обзору литературы 50
Глава 2. Материалы и методы 51
2.1 Вирусологические методы 51
2.2 Методы работы с лабораторными животными 55
2.3 Методы оценки показателей гуморального иммунного ответа 55
2.4 Молекулярно-биологические методы 57
2.5. Методы компьютерного моделирования
2.6 Методы статистической обработки 62
Глава 3. Результаты 63
3.1 Отработка модели для постановки опытов по исследованию показателей гуморального иммунного ответа на вирус гриппа 63
3.1.1 Сравнительный анализ патогенетических особенностей гриппозной и вакцинальной инфекций у морских свинок 63
3.1.2 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с дополнительными аттенуирующими мутациями во внутренних генах 67
3.1.3 Сравнение показателей гуморального иммунного ответа к холодоадаптированным штаммам вируса гриппа с одиночными кодирующими мутациями в гемагглютинине 70
3.1.4 Заключение 71
3.2 Влияние ингибиторочувствительности штамма вируса гриппа на показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок 72
3.2.1 Сравнение ингибитороустойчивого и ингибиторочувствительного вариантов вируса A/Singapore/1/57 (H2N2), имеющих аминокислотные замены в рецептор-связывающей области гемагглютинина, в экспериментах in vitro и in vivo 72
3.2.2 Показатели гуморального иммунного ответа после заражения морских свинок вариантами вируса A/Singapore/1/57 (H2N2) в экспериментах in vivo 75
3.2.3 Характеристика 7:1 и 6:2 реассортантов, унаследовавших неираминидазу от ИЧ или ИУ вируса-родителя 78
3.2.4 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и
6:2 реассортантами на основе вируса гриппа A/California/7/2004 (H3N2) 81
3.2.5 Показатели гуморального иммунного ответа после вакцинации морских свинок 7:1 и
6:2 реассортантами на основе вируса гриппа B/Wisconsin/1/2010 84
3.2.6 Заключение 87
3.3 Отдельные аминокислотные замены в молекуле гемагглютинина и их влияние на показатели гуморального иммунного ответа после иммунизации морских свинок вакцинными штаммами 88
3.3.1 Гетерогенность в аминокислотном составе гемагглютинина популяции дикого вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и реассортантов, полученных на его основе в развивающихся куриных эмбрионах и клетках MDCK 88
3.3.2 Картирование аминокислотных отличий в гемагглютинине клонов дикой популяции A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и вакцинных реассортантов, подготовленных на их основе 91
3.3.3 Показатели гуморального иммунного ответа у морских свинок, вакцинированных штаммами, подготовленными на основе вариантов вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1), имеющих одиночные аминокислотные отличия в гемагглютинине 93
3.3.4 Заключение 96
3.4 Влияние оптимизации кодонного состава гемагглютинина на свойства вирусов гриппа и показатели гуморального иммунного ответа в экспериментах in vivo 97
3.4.1 Характеристика вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине, использованных в работе 97
3.4.2 Фенотипические свойства вирусов H1N1 и H5N1 с измененным составом кодонов в гемагглютинине 101 3.4.3 Показатели гуморального иммунного ответа после введения вирусов H1N1 и H5N1 с
измененным составом кодонов в гемагглютинине в экспериментах in vivo 106
3.4.4 Отработка методики получения вакцинных штаммов ЖГВ на основе штаммов для инактивированной вакцины (PR8 реассортантов) 108
3.4.5 Реассортация вирусов с кодон-оптимизированным гемагглютинином и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 112
3.4.6 Заключение 115
3.5 Связь фенотипических признаков «диких» родительских вирусов с иммуногенностью вакцинных штаммов, подготовленных на их основе:
ретроспективный анализ данных клинических испытаний живой гриппозной вакцины 116
3.5.1 Влияние -фенотипа «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины 116
3.5.2 Влияние ингибиторочувствительности «дикого» родительского 119
3.5.3 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на иммуногенность вакцинных штаммов ЖГВ 120
3.5.4 Возможное влияние комбинации признаков чувствительности к ингибиторам и к температуре инкубации «дикого» родительского вируса на выраженность клинических реакций при введении ЖГВ 121
3.5.5 Заключение 122
Глава 4. Обсуждение результатов 123
Раздел 3. Заключение 138
Выводы: 139
Благодарность 140
Список основных сокращений 141
Список иллюстративного материала
