Введение
1. Список сокращений 5
2. Введение
2.1. Актуальность работы 7
2.2. Цели и задачи работы 8
2.3. Новизна и научная значимость работы 8
2.4. Личный вклад автора 9
2.5. Методология и методы исследования 9
2.6. Положения, выносимые на защиту 10
2.7. Степень достоверности и апробация результатов 10
3. Обзор литературы 12
3.1. Клеточное старение 13
3.2. Причины активации клеточного старения 17
3.2.1. Разворачивание теломерной петли 18
3.2.3. Клеточное старение, вызванное повреждением ДНК 20
3.2.4. Клеточное старение, индуцированное ионизирующей радиацией 21
3.2.5. Клеточное старение, индуцированное ультрафиолетом 22
3.2.6. Клеточное старение и активные формы кислорода 24
3.2.7. Клеточное старение, индуцированное гипоксией 25
3.2.8. Клеточное старение, вызванное сверхэкспрессией онкогенов 26
3.2.9. Низкомолекулярные соединения, вызывающие клеточное старение
3.3. Влияние гипертермии на клеточную пролиферацию 34
3.4. Повреждающие эффекты теплового стресса
3.4.1. Изменение структуры и локализации белков 36
3.4.2. Регуляция экспрессии генов при тепловом стрессе 37
3.4.3. Нарушение целостности ДНК 39
4. Материалы и методы 41
4.1. Материалы 41
4.2. Методы 43
4.2.1. Культивирование клеток человека и синхронизация двойным тимидиновым блоком 43
4.2.2. Тепловой стресс и обработка химическими агентами 43
4.2.3. Включение аналогов нуклеотидов 44
4.2.4. РНК-интерференция 44
4.2.5. Иммуноцитохимия и микроскопия 44
4.2.6. Совместное иммунофлуоресцентное окрашивание против белка TRF2 и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробой к теломерным повторам 45
4.2.7. Измерение активности -галактозидазы 46
4.2.8. Выделение РНК 46
4.2.9. Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени
4.2.10. Приготовление белковых экстрактов и вестерн-блот гибридизация 47
4.2.11. Проточная цитофлуориметрия 48
4.2.12. Нейтральный гель-электрофорез одиночных клеток (метод ДНК-комет) 48
4.2.13. Определение активности ДНК-топоизомеразы I (метод релаксации плазмидной ДНК) 49
4.2.14. K+-ДСН-преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов 50
4.2.15. Преципитация ковалентных ДНК-белковых комплексов этанолом (RADAR)
5. Результаты и обсуждение 52
5.1. Тепловой стресс индуцирует преждевременное старение клеток человека 5.2. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, развивается по p21-зависимому пути 54
5.3. Только клетки, находящиеся в ранней s-фазе клеточного цикла в момент теплового стресса, приобретают фенотип клеточного старения 55
5.4. Преждевременное старение, индуцированное тепловым стрессом, останавливает пролиферацию клеток в g2-фазе клеточного цикла 57
5.5. Тепловой стресс индуцирует персистирующие сигналы о повреждениях днк только в клетках, находящихся в ранней s-фазе 58
5.6. В результате теплового стресса возникают две волны фосфорилирования гистона h2ax, осуществляемого разными киназами 60 5.7. Индуцированная тепловым стрессом диссоциация trf2 не является источником сигналов о повреждении днк 63
5.8. Ингибирование днк-топоизомеразы i приводит к преждевременному старению клеток, находящихся в ранней s-фазе 65
5.9. Тепловой стресс ингибирует днк-топоизомеразу i в клетках человека 67
5.10. Днк-топоизомераза i необходима для развития индуцированного тепловым стрессом клеточного старения 69
5.11. Репликация днк необходима для индукции клеточного старения, вызванного тепловым стрессом или действием камптотецина 70
5.12. Двуцепочечные разрывы днк являются источником персистирующих сигналов о повреждениях днк 72
5.13. Формирование персистирующих сигналов о повреждениях днк, индуцированных тепловым стрессом, зависит от транскрипционной и протеосомной активностей 74
5.14. Основной причиной индукции генотоксическим стрессом клеточного старения, являются одноцепочечные разрывы 6. Заключение 79
7. Выводы 80
8. Список литературы
