Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 11
2.1. Описание заболевания 11
2.2. Общая характеристика вируса гриппа 13
2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N1 19
Передача вируса 19
Клинические проявления. 20
Патогенез. 23
2.4. Способы диагностики вируса гриппа 27
2.4.3. Иммуноферментный анализ 30
2.4.4. Молекулярные методы 32
2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция 32
2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 38
3. Материалы и методы 44
3.1. Материалы 44
3.2. Методы 50
4. Результаты 60
4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа Н5N1 методом ПЦР . 60
4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР. 60
4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы. 62
4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы 66
4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы 68
4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени. 72
4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР. 72
4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 75
4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени. 78
4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени 81
4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N1 82
4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики. 86
4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality
Assessment Programm (EQAP) 88
4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N1 89
4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS1. 94
4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа. 94
4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1. 99
5. Обсуждение результатов. 102
6. Выводы 112
7. Библиография 114
8. Приложения 130
