Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. История открытия флуоресцентных белков 8
1.2. Характеристика GFP: структура и свойства 9
1.3 Биологическая функция флуоресцентных белков 12
1.4 Применение флуоресцентных белков 13
1.5 Проблема олигомеризации флуоресцентных белков 18
1.6 Мономерные флуоресцентные белки 20
1.7 Заключение 35
2. Материалы и методы 37
2.1 Оборудование и реактивы 37
2.1.1 Оборудование 37
2.1.2 Реактивы 38
2.1.3 Буферные растворы 39
2.1.4 Микробиологические среды 39
2.1.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии 40
2.2 Методы исследования и анализа результатов 40
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК 40
2.2.2. Случайный (Random) мутагенез 41
2.2.3. Сайт-специфический мутагенез 42
2.2.4. Трансформация клеток Е. Coli з
2.2.5. Выделение плазмидной ДНК 43
2.2.6. Переосаждение ДНК 43
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 44
2.2.8 Выделение и очистка рекомбинантных белков 44
2.2.9 Определение скорости созревания хромофора 45
2.2.10 Гель-фильтрация 46
2.2.11 Спектроскопические методы 46
2.2.12. Трансфекция эукариотических клеток
2.2.14 Получение рекомбинантных конструкций 49
2.2.14.1 Получение бактериальных экспрессионных векторов 49
2.2.14.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов 50
2.2.14.3 Получение FusionRed 51
2.2.14.4 Получение mKateKFPl и mKateKFP2 53
2.2.14.5 Получение FusionRed-657 53
2.2.15 Трансгенные Xenopus laevis 55
3. Результаты и обсуждение 56
3.1 Красный мономерный флуоресцентный белок 56
3.1.1 Получение белка FusionRed 56
3.1.2 Характеристика и сравнение FusionRed с аналогами in vitro 60
3.1.3 Характеристика и сравнение белка FusionRed с аналогами in vivo64
3.2. Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки 71
3.2.1 Получение белков mKateKFPl и mKateKFP2 72
3.2.2 Изучение фотоактивационных свойств белков mKateKFPl и mKateKFP2 73
3.3. Дальне-красный мономерный белок 77
3.3.1 Получение дальне-красного мономерного белка 78
3.4 Заключение 85
Выводы 87
Список литературы
