Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма 8
1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета 9
1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма 11
1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне 12
1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов 12
1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов 14
1.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов 16
1.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге 18
1.3. Ядерные рецепторы PPAR на перекрестке метаболических и регуляторных
сигнальных путей. 21
1.3.1. Структурные свойства PPAR и механизмы регуляции ими экспрессии генов 22
1.3.2. Экзогенные и эндогенные лиганды PPAR 24
1.3.3. Роль PPAR в регуляции генов липидного метаболизма 25
1.3.4. Регуляция PPAR на молекулярном уровне 30
1.4. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов PPAR, , при
стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии. 31
1.4.1. Клеточные модели гипергликемии 33
1.4.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе 33
1.4.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции. 36
1.4.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии 40
1.5. Постановка целей и задач исследования 41
2. Материалы и методы 43
2.1. Приборы 43
2.2. Реактивы и препараты 43
2.3. Выделение и культивирование клеточных линий 46
2.3.1. Первичные астроциты крысы 46
2.3.2. Клеточная культура HeLa 47
2.3.3. Клеточная культура С6 48
2.3.4. Оценка пролиферации клеток 48
2.4. Выделение тотальной РНК 49
2.5. Определение экспрессии генов 51
2.6. Иммуноблотинг и электрофорез 53
2.7. Измерение концентрации простагландина (PG) Е2 54
2.8. Измерение ДНК-связывающей активности PPAR 55
2.9. Статистический анализ 57
3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии HeLa. 58
3.1.1. Влияние LPS на экспрессию генов COX-1 и COX-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы 59
3.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-261
3.1.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPAR, PPAR и PPAR 63
3.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов PPAR, - и -. 64
3.2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях гипергликемии 69
3.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по GFAP для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы. 69
3.2.2. Влияние глюкозы на выброс PGE2 и TNF в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета. 71
3.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPAR, -, - при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии. 72
3.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета. 74
3.2.5. Модуляция LPS-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью MAPK ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования. 77
3.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах . 81
3.3.1. TLR-агонисты подавляют уровень экспрессии PPAR и PPAR, но увеличивают экспрессию PPAR 81
3.3.2.Характеристика LPS-стимулированной экспрессии мРНК и белка PPAR, -, -. 86
3.3.3. Скорость распада мРНК PPAR, -, -. замедляется при активации TLR4. 91
3.3.4. Активация р38 и скорость деградации мРНК 93
3.3.5. Модуляция экспрессии и активности PPAR, -, - различными ингибиторами MAPK 94
3.3.6. Роль р38 в регуляции экспрессии PPAR, -, -. 103
3.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPAR, -, -. 104
3.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции TLR 107
3.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах. 114
4. Выводы 118
5. Список литературы 119
