Введение
ЧАСТЬ 1. Обзор литературы
1.1. История синтеза и первые исследования ДМХ 9
1.2. Влияние химической структуры молекулы халкоиов на электронные спектры поглощения 9
1.3. Влияние химической структуры молекулы на флуоресцентные свойства халкоиов 12
1.4. Структура моле культ ДМХ 12
1.5. Спектральные характеристики ДМХ 13
1.6. Квантовый выход флуоресценции ДМХ 14
1.7. ДМХ как люминесцентный индикатор 15
1.8. ДМХ как флуоресцентный зонд для исследования биологических объектов 16
1.9. Исследования структуры мембран с помощью флуоресцентных зондов 17
1.9.1. Модель гетерогенных мест связывания зонда в мембране
"Кластерная модель" структуры мембран 17
1.9.2. "Релаксационная модель" структуры липидного бислоя 18
1.9.3. Модель "TWICT" 19
1.10. Локализация зондов в лнпндпом бислое.
Физико-химическая структура мембаны 22
1.11. Флуоресцентный зонд ДМХ в исследованиях липопротеинов и клеток 25
1.12. Клеточный состав крови 26 1.12. Лнпидный состав клеток крови 27
1.14. Способность клеток крови к синтезу липидов 29
1.15. Внутриклеточные липндные частицы клеток крови 30
ЧАСТЬ 2. Результаты исследований
Глава 1. Материалы и методы исследований 34
2.1. Реактивы и среды 34
2.2. Приготовление липосом и липидпых шаров 34
2.3. Выделение лппопротеппов 35
2.4. Выделение клеток 36
2.4.1. Лимфоциты из тимуса крыс 36
2.4.2. Лимфоциты из периферической крови человека 36
2.4.3. Гранулоциты из периферической крови человека 37
2.5. Субклеточное фракционирование 37
2.5.1. Сканирующая электронная микроскопия 38
2.5.2. Трансмиссионная электронная микроскопия 38
2.6. Аналитические методы 39
2.6.1. Определение белка
2.6.2. Определение нуклеиновых кислот
2.6.3. Определение фосфолипида
2.7. Флуоресцентные зонды 39
2.8. Флуоресцентные измерения 41
2.8.1. Флуоресцентная микроскопия 41
2.8.2. Регистрация стационарных спектров флуоресценции 41
2.8.3. Регистрация безызлучателыюго переноса энергии 41
2.8.4. Проточная цитофлуорометрия клеток 41
2.8.5. Регистрация кинетики затухания флуоресценции 42
2.9. Спектрофотометрические измерения 42
2.10. Измерение фосфоресценции 43
2.11. Фемтосекундная абсорбционная спектрофотометрів 43
2.12. Измерение кондуктометрнческого объёма клеток 43
2.13. Квантовохнмические расчеты 44
Глава 2. Создание экспериментальных установок для исследования клеток крови
2.2.1. Установка для разрушения цитоплазматическоГі мембраны лейкоцитов 44
2.2.2. Проточный цктофлуориметр для исследования клеток мембранными флуоресцентными зондами 46
Глава 3. Исследование оптических свойств ЛМХ
3.1. Квантово-химнческие расчеты свойств молекулы ДМХ 50
3.1.1. .Квантово-химическне расчёты и кристаллографическое исследование конформации молекулы ДМХ в основном состоянии 51
3.1.2. Квантово-химичсскне расчеты электронных переходов в молекуле ДМХ 58
3.1.3. Дипольный момент молекулы ДМХ в основном состоянии (jig) 62
3.2. Оптические свойства зонда ДМХ в органических растворителях 63
3.2.1. Влияние растворителя на положение максимумов спектров
поглощения и флуоресценции зонда ДМХ 63
3.2.2. Дипольный момент возбужденного состояния молекулы ДМХ (jie) 66
3.2.3. Квантовый выход флуоресценции ДМХ в
органических растворителях 67
3.2.4. Влияние вязкости я дипольного момента молекулы растворителя на флуоресценцию ДМХ 70
3.2.5. Влияние полярности среды на динамику процессов релаксации в возбужденном состоянии. Фемтосекундная спектроскопия 72
3.2.6. Фосфоресценция ДМХ в неполярної! и полярной средах 78
3.2.7. Барьер перехода ДМХ из флуоресцирующего в нефлуоресцирующее состояние 79
3.2.8. Влияние температуры и полярности среды
на спектр поглощения ДМХ 83
Глава 4, Использование ЛМХ для исследования мицеллярных и ламмелярных липидных структур R лимфоцитах кропи
4.1. Флуоресценция зонда ДМХ в модельных липидных мембранах (лнпосомах) 89
4.1.1. Спектры флуоресценции ДМХ в мебранах различного липидного состава 89
4.1.2. Определение параметров связывания ДМХ с липосомами 90
4.1.3. Коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ДМХ в лнпосомах 94
4.2. Флуоресценция зонда ДМХ в субклеточных арганеллах лимфоцитов 96
4.2.1. Субклеточное фракционирование 96
4.2.2, Разделение и биохимическая характеристика субклеточных фракций 99
4.2.3. Морфологическая характеристика выделенных фракций 101
4.2.4, Связь между интенсивностью флуоресценции ДМХ и биохимическим составом субклеточных фракций 104
4.3. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах периферической крови человека 106
4.3.1. Спектры флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах 106
4.3.2. Проточная цитофлуорометрия лейкоцитов, окрашенных зондом ДМХ 107
4.3.3. Флуоресценция зонда ДМХ в выделенных фракциях лимфоцитов и гранулоцитов 108
4.3.4. Разложение гистограмм клеток крови на составляющие. Сравнение результатов разложения сданными гематологического анализа мазков крови 109
4.3.5. Вклад эритроцитов и тромбоцитов в гистограмму распределения клеток крови по флуоресценции зонда ДМХ 112
4.3.6. Флуоресценция ДМХ в лейкоцитах крови здоровых доноров 114
4.4. Исследование пространственной структуры липида в лейкоцитах крови человека методом безызлучателыюго переноса энергии 114
4.4.1. Перенос энергии между молекулами флуоресцентных зондов К-68 и ДСП-12 в лимфоцитах 116
4.4.2. Влияние трансмембрапных полей лимфоцита на распределение зондов К-68 и ДСП-12 в клетке 118
4.4.3. Влияние зонда К-68 на катионаккумулирующую способность митохондрий лимфоцитов 119
4.4.4. Исследование пространственной струтуры липида в лейкоцитах по результатам переноса энергии между молекулами флуоресцентных зондов К-68, ДМХ и ДСП-12 121
4.5. Возможные причины различий флуоресценции ДМХ в лимфоцитах и гранулоцитах 126
Заключение 128
Выводы 130
Литература
