Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ II
2.1. Локализация ФПФаз II
2.2. Субстратная специфичность ФПФаз . II
2.3. Множественные формы ФПФаз . 14
2.4. Субъединичная структура ФПФаз 17
2.5. Углеводсодержащие кислые ФПФазы . 22
2.6. ФПФазы клеточных ядер 24
2.7. Классификация ФПФаз 26
2.8. Термостабильные регуляторные белки ФПФаз 30
2.9. Роль пирофосфатсодержащих соединений, фторида и ионов двухвалентных металлов в регуляции активности ФПФаз 33
2.10. Влияние гормонов на уровень ФПФазной активности 35
2.11. Регуляция ФПФаз глутатионом и полиаминами 37
2.12. Механизм действия фосфата з 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
3.1. Выделение клеточных ядер из селезенки быка 44
3.2. Экстракция из ядер и очистка ФПФазы 44
3.3. Определение активности и Е^ ФПФазы 45
3.4. Электрофоретическое разделение белков 46
3.5. Идентификация ядерной ФПФазы методом двойных флуоресцирующих антител 47
3.6. Определение молекулярной массы ФПФазы .. 48
3.6.1. Определение молекулярной массы ФПФазы методом гель-хроматографии на сефадексе
3.6.2. Определение молекулярной массы ФПФазы
электрофорезом в ПААГ в нативных условиях 49
3.7. Определение аминокислотного состава ФПФазы. 50
3.8. Количественное определение свободных сульфгид-рильных групп и дисульфидных мостиков 51
3.9. Изучение спектра поглощения ФПФазы в видимой области 52
3.10. Иммобилизация ФПФазы 52
З.П. Изучение влияния температуры и рН на активность растворимой и иммобилизованной ФПФазы 52
3.12. Влияние ингибиторов на активность ФПФазы 53
3.13. Влияние модификаторов аминокислот на активность ФПФазы 54
3.I3.I. Влияние модификаторов сульфгидрильных групп на активность ФПФазы 54
3.13.2. Влияние ТНБС на активность ФПФазы . 55
3.13.3. Влияние ДЭПК на активность ФПФазы . 56
3.14. Изучение трансфосфорилирования в присутствии ФПФазы 56
3.15. 180-обмен в системе с ФПФазой 57
3.15.1. Постановка опытов хо0-обмена 57
3.15.2. Выделение и очистка Ф„ и НФ для анализа на содержание хо0. 57
3.15.3. Подготовка образцов Фн и НФ к масс-спектрометрическому анализу . 58
3.15.4. Анализ изотопного состава кислорода в С02 59
3.15.5. Расчеты содержания 180 в образцах 59
3.16. Выделение комплекса 35Р-ФПФаза 60
3.17. Определение концентрации белка 61
3.18. Определение содержания углеводов в составе ФПФазы 61
3.19. Статистическая обработка экспериментальных данных 62
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
4.1. Выделение и очистка ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 63
4.2. Субстратная специфичность и к^ ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 70
4.3. Молекулярная масса ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 74
4.4. Химический состав и спектр поглощения ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 77
4.5. Иммобилизация ФПФазы из ядер селезенки быка и сравнительная характеристика иммобилизованной и растворимой форм фермента 83
4.6. Ингибиторы ФПФазы ядер селезенки быка 89
4.7. Влияние модификаторов аминокислотных остатков
на активность ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 98
4.8. Механизм действия ФПФазы из клеточных ядер селезенки быка 102
4.8.1. 180-обмен в ходе гидролиза АДФ и пНФФ ФПФазой из ядер селезенки быка
4.8.2. Трансфосфорилирование в присутствии ядерной ФПФазы из селезенки быка 106
4.8.3. Выделение фосфорилированного фермента после преинкубации ядерной ФПФазы с
меченым субстратом
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. ВЫВОДЫ . 125
7. ЛИТЕРАТУРА 128
