Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1. Дефекты системы эксцизионнои репарации нуклеотидов наследственные заболевания. идентификация факторов репарации 9
1.1.1. Заболевания человека, вызванные дефектами системы эксцизионной репарации нуклеотидов 9
1.1.2. Идентификация генов и белков, участвующих в NER 13
1.2. Организация эксцизионной репарации нуклеотидов 17
1.2.1. Модели сборки репарационного комплекса в репарации целого генома 17
1.2.2. Репарация, связанная с транскрипцией 19
1.3. Узнавание повреждения в процессе эксцизионной репарации нуклеотидов 21
1.3.1. Модели узнавания повреждения: "ХРС первый", "ХРА первый" или "RPA первый" 21
1.3.2. Модель двухкомпонентного узнавания повреждений ДНК 23
1.4. Факторы эксцизионной репарации нуклеотидов 24
1.4.1. Комплекс XPC-hHR23B - потенциальный сенсор неспаренных оснований 24
1.4.2. Функции UV-DDB в эксцизионной репарации нуклеотидов 28
1.4.2.1. Роль UV-DDB в узнавании повреждений 28
1.4.2.2. Участие UV-DDB в реорганизации хроматина 32
1.4.2.3. UV-DDB и убиквитинилирование 33
1.4.3. Роль ХРА и RPA в NER 33
1.4.4. TFIIH: раскрытие ДНК вокруг повреждения 37
1.4.5. XPG и ERCC1-XPF: двойное разрезание поврежденной цепи эндонуклеазами 39
1.4.6. Застройка одноцепочечной бреши (ресинтез ДНК) 42
1.4.7. Дополнительные функции белков эксцизионной репарации нуклеотидов 43
1.4.1.7.1. Роль TFI1Hв транскрипции 43
1.4.7.2. Участие белков NER в эпигенетическом контроле 44
1.4.7.3. Стимулирование системы BER: участие в спонтанном мутагенезе 44
1.4.7.4. Участие ХР-генов в контроле клеточного цикла и апоптозе 46
1.4.7.5. Роль ERCC1-XPF в других путях репарации 47
1.5. Регуляция процесса эксцизионной репарации нуклеотидов с помощью посттрансляционной модификации 50
Заключение 51
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 53
2.1. Материалы 53
2.2. Методы исследования 59
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного ХРА человека, экспрессированного в клетках Е. coli 59
2.2.2. Гель-электрофорез нуклеиновых кислот и белков в ПААГ 61
2.2.3. Введение С Р)-метки по 5-концу олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов 63
2.2.4. Формирование ДНК-дуплексов 63
2.2.5. Удлинение ДНК-праймера, катализируемое Pol /3 (введение модифгщированных dNTP в 3 -конец праймера) 64
2.2.6. Лигирование одноцепочечногоразрыва (пика), катализируемое ДНК-лигазой фага Т4 (получение олигонуклеотидов с модифицированным dNMP в середине ijemi)64
2.2.7. Комплексообразование белков с ДНК (метод задержки в геле) 65
2.2.8. Фотоаффинная модификация белков 65
2.2.9. Конструирование двухцепочечной плазмиды, содержащей модифицированные dNMP 66
2.2.10. Вырезание повреждения системой NER 61
2.2.11. Идентификация продуктов модификации XPC-hHR23В помощью иммуноблоттинга 68
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 70
РАЗДЕЛ 3.1 . Фотоактивные нуклеотиды имитируют повреждения, выщепляемые системой эксцизионнои репарации нуюіеотидов . 70
3.1.1. Конструирование олигонуклеотидов, содержагцих фотоактивируемую группу в середине цепи 71
3.1.2. Конструирование двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивируемую группу 72
3.1.3. Выщепление повреждения из двухцепочечных кольцевых ДНК, содержащих фотоактивную группу, в клеточном экстракте HeLa 73
РАЗДЕЛ 3.2 . Взаимодействие xpc-hr23b с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов 78
3.2.1. Взаимодействие XPC-HR23В с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреждения фотореащионноспособные производные нуклеотидов -FAP-dCMP и FAP-dUMP 79
3.2.2. Взаимодействие XPC-HR23B с модельными ДНК-структурами, содерэюащими фотореащионноспособные остатки в поврежденной и неповрежденной цепи 84
РАЗДЕЛ 3.3. Взаимодействие хра и rpa с модельными днк-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов 88
5.5.7. Взаимодействие RPA и ХРА с модельными ДНК-структурами, содержащими в качестве повреэюдения фотореакционноспособные производные нуклеотидов - FAP-dCMP и FAP-dUMP 88
3.3.2. Взаимодействие ХРА и RPA с модельными ДНК-структурами, содержащими фотореакционноспособные производные нуклеотидов в поврежденной и неповрежденной цепи 96
3.3.3. Взаимодействие RPA и ХРА с модельными фотоактивными ДНК-структурами, содерэюащими модифицированный dNMP на 3- и 5 -конце одноцепочечного разрыва 101
РАЗДЕЛ 3.4. Влияние rpa и хра на взаимодействие xpc-hr23b с модельными фотореакционноспособными днк-структурами 107
3.4.1. Влияние RPА и ХРА на модификацию XPC-HR23B с фотоактивируемыми ДНК-структурами, содерэюащими FAP-dCMP 107
3.4.2. Влияние RPA и ХРА на эффективность комплексообразования XPC-hHR23B с ДНК ПО
Заключение 114
Выводы 117
Список литературы 118
