Введение
1 «Аннексины - семейство Са2+/фосфолипидсвязывающих белков» 9
1. Са2+-связывающие белки в регуляции зрительной трансдукции 9
1.1. Общая схема зрительной трансдукции 9
1.2. Регуляция зрительной трансдукции. 14
2. Структура и общие свойства аннексинов 21
2.1. Номенклатура 21
2.2. Тканевая и внутриклеточная локализация 22
2.3. Гены и первичная структура 27
2.4. Вторичная и третичная структуры 31
2.5. Димеризация и четвертичная структура 39
2.6. Связывание с мембранами и агрегация клеточных мембран 40
2.7. Взаимодействие с лигандами нелипидной природы 47
3. Функциональная активность аннексинов 54
3.1. Участие в транспорте и организации клеточных мембран 55
3.2. Регуляция проводимости и образование ионных каналов 59
3.3. Участие в клеточной пролиферации и дифференцировке, 61
3.4. Аннексины в крови и межклеточном пространстве 62
4. Аннексинопатии 65
2 Материалы и методы 67
1. Реактивы 67
2. Выделение НСП из сетчаток быка и получение экстракта НСП 67
3. Очистка аннексина А4 (р32) из НСП и печени быка 68
4. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран. 69
5. Получение поликлональных моноспецифических антител против аннексина А4 из печени быка 70
6. Получение фракции белков НСП, способных Са -зависимым образом взаимодействовать с иммобилизованным аннексином А4 70
7. Определение концентрации белков 71
8. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 71
9. Иммуноблотгинг. 71
10. Масспктрометрический анализ белковых препаратов 72
11. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов сетчатки и печени 73
12. Связывание аннексина А4 с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами 74
13. Агрегация отмытых мочевиной фоторецепторных мембран в присутствии аннексина А4 75
3 Результаты и их обсуждение 76
1. Выделение и очистка фоторецепторного белка р32 и его идентифика ция как аннексина А4 77
1.1. Получение и характеристика фракции фоторецепторных "Са -зависимых" белков 77
1.2. Выделение и очистка фоторецепторного белка с кажущейся молекулярной массой 32 кДа (р32) 78
1.3. Доказательство способности гомогенного р32 взаимодействовать с фоторецепторными мембранами Са2+-зависимым образом 81
1.4. Идентификация р32 как аннексина А4 83
1.5. Изучение локализации аннексина А4 в сетчатке быка 85
2. Изучение функциональных свойств фоторецепторного аннексина А4 90
2.1. Взаимодействие аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 92
2.1.1. Са +-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 92
2.1.2. 2п2+-зависимое связывание аннексина А4 с фоторецепторными мембранами 98
2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран 102
2.2.1. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов кальция 103
2.2.2. Аннексии А4-зависимая агрегация фоторецепторных мембран в присутствии ионов цинка 105
3. Поиск потенциальной белковой мишени (мишеней) для аннексина А4 в фоторецепторной клетке 110
3.1. Выявление растворимых белков НСП, связывающихся с иммобилизованным аннексином А4 Са2+-зависимым образом 111
3.2. Идентификация потенциальных белковых мишеней аннексина А4 112
Выводы 123
