Введение
I. Организация и функционирование убиквитин-протеасомной системы (УПС) 7
1.1. 26S протеасома 7
1.1.1. Иммунопротеасома 11
1.1.2. Разнообразие регуляторних комплексов протеасом 11
1.1.3. Внутриклеточная локализация протеасом 12
1.1.4. Сборка протеасом 13
1.2. Система убиквитинирования белков 14
1.2.1. Убиквитин и ферменты системы убиквитинирования 15
1.2.2. Деубиквитинирование 16
1.2.3. Механизмы распознавания белковых субстратов 17
1.2.3.1. N-концевой аминокислотный остаток: N-концевое правило деградации 17
1.2.3.2. Сигнальные последовательности 18
1.2.3.3. Роль фосфорилирования в узнавании белков системой убиквитинирования 19
1.2.3.4. Деградация белков с нарушенной третичной структурой 19
1.2.3.5. Маскирование сигналов протеолиза 20
1.2.3.6. Узнавание субстратов in trans 20
1.3. Протеолитические функции УПС 21
1.3.1. Полное расщепление белковых субстратов 21
1.3.1.1. Регуляция активности белков 21
1.3.1.2. Система деградации белков эндоплазматического ретикулума 22
1.3.1.3. Деградация новосинтезированных полипептидных цепей 23
1.3.1.4. Образование антигенных олигопептидов 23
1.3.2. Процессинг полипептидов путем ограниченного протеолиза 24
1.4. Не протеолитические функции компонентов убиквитин-протеасомной системы 25
1.4.1. Везикулярный транспорт 26
1.4.2. Гистоновый код 26
1.4.3. Репарация ДНК 28
1.4.4. Регуляция активности транскрипционных факторов путем моноубиквитинирования 29
1.4.5. Привлечение протеасомных субъединиц к активно транскрибируемым генам 31
II. Регуляция экспрессии протеасомных генов у эукариот 33
2.1. Система регуляции транскрипции протеасомных генов у Saccharomyces cerevisiae 33
2.1.1. РАСЕ 33
2.1.2 Выяснение роли Rpn4p и его характеристика 35
2.1.3. Механизмы деградации Rpn4p 37
2.1.4, Модель регуляции протеасомных генов по принципу отрицательной обратной связи 38
2.2. РАСЕ и гомологи Rpn4p у дрожжей подкласса Hemiascomyctes 39
2.3. Регуляция транскрипции протеасомных генов у высших эукариот 40
III. Структура эукариотических трансактиваторов 43
3.1. ДНК-связывающие домены 44
3.1.1. ДНК-связывающие домены, содержащие мотив «спираль-петля- спираль» 44
3.1.2. ДНК-связывающие домены, содержащие цинк («цинковые пальцы») 44
3.1.2.1. (Зра-цинковые пальцы (С2Н2) 44
3.1.2.2. Семейство рецепторов гормонов 45
3.1.2.3. ДНК-связывающие домены с мотивом «петля-слой- спираль» 45
3.1.2.4. Семейство Gal4 46
3.1.3. ДНК-связывающие домены факторов, содержащих «лейциновуюзастежку» 46
3.1.3.1. Семейство факторов с «лейциновой
застежкой» 46
3.1.3.2. Семейство факторов с мотивом «спираль-петля- спираль» 47
3.1.4. Белки с р-слойным ДНК-связывающим доменом 47
3.2. Трансактиваторные домены 47
3.2.1. Кислые трансактиваторные домены 49
3.2.2. Глутамин-богатые трансактиваторные домены 50
3.2.3. Пролин-богатые трансактиваторные домены 51
3.2.4. Серин/треониновые трансактиваторные домены 52
3.3. Сигналы ядерной локализации 53
Заключение 55
Материалы и методы 56
Материалы 56
Методы 61
1. Получение плазмидиых конструкций 61
2. ПЦР-мутагенез 64
3. Выделение Rpn4 из Е. coli 64
4. Трансформация нативных клеток S. cerevisiae плазмидной ДНК 65
5. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 66
6. Выделение суммарной РНК из дрожжей 66
7. Агарозно-формальдегидный электрофорез РНК 67
8. Синтез кДНК 67
9. Полуколичественная ПНР 69
10. ПЦР в реальном времени 71
11. Метод выращивания серии разведений дрожжевой культуры на чашках Петри 72
12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS 72
13. Вестерн-блоттинг 72
14. Метод формальдегидной фиксации и иммунопреципитации хроматина...73
Результаты 75
1. Rpn4p - позитивный и негативный транскрипционный регулятор убиквитин-протеасомной системы 75
2. Анализ С-концевой области Rpn4p 78
3. Анализ центральной части Rpn4p 81
4. Анализ, N-концевой области Rpn4p 84
5. Мутационный анализ N-концевого трансактиваторного домена 88
Обсуждение результатов 90
Выводы 95
Список литературы
