Введение
Обзор литературы 4
Введение. Иммунитет растений 4
Антимикробные пептиды растений 6
Дефензины 8
Тионины 11
Гевеиноподобные пептиды 15
Липид-переносящие белки 16
Ноттиноподобные пептиды 18
Макроциклические пептиды (циклотиды) 20
Ингибиторы -амилаз 21
Ноттиноподобные ИАА 22
ИАА дефензинового типа 23
Ингибиторы протеаз 23
Ингибиторы сериновых протеаз 26
ИП семейства Кунитца. 29
ИП семейства Баумана-Бирка (ББИ) 30
ИП семейства тыквенных (Squash) 33
ИП семйства горчичные (MSI – от англ. Mustard (Sinapis) trypsin inhibitor) 33
ИП картофеля типа 1 (PI 1) 34
ИП картофеля типа II (PI 2) 35
Фитоцистатины, растительные ингибиторы цистеиновых протеаз. 35
Злаковые ингибиторы трипсина/-амилаз 36
Ингибиторы аспартатных и металлопротеаз 36
Заключение 37
Материалы и методы 39
1. Материалы 39
2. Оборудование 40
3. Программное обеспечение 43
4. Методы 44
1. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) 44
2. Масс-спектрометрия 45
3. Восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом 45
4. Алкилирование тиольных групп 4-винилпиридином 45
5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности. 46
6. Селективный гидролиз полипептидов 46
7. Определение концентрации полипептидов. УФ-спектрофотометрия 47
8. Полимеразная цепная реакция 47
9. Рестрикция линейных фрагментов ДНК и плазмиды pET-32b 48
10. Лигирование линейных фрагментов ДНК и лианеризованной плазмиды pET-32b 48
11. Электрофорез в агарозном геле 48
12. Выделение ДНК из агарозного геля 48
13. Трансформация E. coli методом электропорации 49
14. Трансформация E. coli методом теплового шока 49
15. Выделение плазмидной ДНК 50
16. Секвенирование ДНК 50
17. Контролируемая экспрессия гибридного белка в клетках E. coli 50
18. Выделение растворимой фракции белков из клеток E. coli 51
19. Аффинная хроматография 51
20. Ферментативный гидролиз гибридного белка с использованием энтеропептидазы 51
21. Гель-электрофорез в полиакриламидном геле 51
22. Тестирование ингибирующей активности 52
23. Приготовление липосом 52
24. Тестирование способности пептидов к взаимодействию с липидными везикулами 53
25. Измерение антифунгальной активности 53
Результаты и обсуждения 54
1. Выделение и структурная характеристика ингибитора трипсина из семян гречихи 54
2. Получение рекомбинантных аналогов пептидов в бактериальной системе 58
3. Структурные исследования полученных пептидов 63
4. Исследование биологической активности полученных пептидов 69
5. Получение производных, структура, активность. 72
Выводы 77
Список использованной литературы 78
