Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов 12
1.1.1 .Общие сведения о бактериальных токсинах 12
1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов 12
1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности 13
1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов 14
1.2. Типы бактериальных гемолизинов 16
1.2.1. Фосфолипазы - цитолизины с ферментативной активностью 16
1.2.2. Порообразующие гемолизины 18
1.2.2.1. Гемолизин Е. coli и семейство RTX 18
1.2.2.2. Гемолизины семейства Proteus/Serratia 19
1.2.2.3. Р-Складчатые каналобразующие цитолизины. Семейство SH-токсинов 20
1.2.2.4. р-Складчатые каналобразующие цитолизины аэролизинового типа: а-Гемолизин S. aureus 22
1.3. Регуляция экспрессии генов бактериальных гемолизинов 24
1.3.1. Общие принципы регуляции 24
1.3.2. Системы, контролирующие гены гемолизинов у Staphylococcus aureus 25
1.3.3. Генетические механизмы, контролирующие экспрессию гемолизинов у Listeria monocytogenes 26
1.3.4. Регуляция экспрессии гемолизинов у Clostridiumperfringens 28
1.4. Гемолизины Bacillus cereus 29
1.4.1. В. cereus как объект для изучения гемолизинов 29
1.4.2. Спектр гемолизинов, продуцируемых Bacillus cereus 31
1.4.2.1. Сфингомиелиназа и цереолизин АВ 32
1.4.2.2. Цереолизин (гемолизин I) 34
1.4.2.3. Гемолизин BL 35
1.4.2.4. Гемолизин III 37
1.4.2.5. Гемолизин IV (токсин CytK) 38
1.4.2.6. Цереолизинподобный гемолизин 39
1.4.2.7. Гемолизин II 39
1.4.3. Регуляция продукции гемолизинов у В. cereus 42
Глава II. Материалы и методы исследования 45
П. 1. Материалы 45
II. 1.1. Штаммы бактерий, фаговые и плазмидные векторы 45
II. 1.2. Среды и основные буферы 45
И. 1.3. Материалы и реактивы 46
II.2. Методы исследования 47
Н.2.1. Выделение тотальной ДНК из микроорганизмов рода Bacillus 47
Н.2.2. Выделение плазмидной ДНК 48
П.2.3. Выделение одноцепочечной ДНК фага М13 48
И.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК 49
П.2.5. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация 49
П.2.6. Получение компетентных клеток В. subtilis и их трансформация 50
И.2.7. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу 50
И.2.8. Тестирование клонов на наличие активности фосфолипазы С 50
И.2.9. Анализ рекомбинантных клонов 51
И.2.10. Проведение реакций модификации ДНК 51
II.2.11. ПЦР-амплификация ДНК 51
Н.2.12. Плазмидные конструкции 51
Н.2.13. Определение и анализ первичной последовательности ДНК 52
11.2.14. ДНК-ДНК гибридизация 53
11.2.15. Получение миниклеток и анализ их белков, кодируемых плазмидами 53
11.2.16. Получение бесклеточных экстрактов 54 П
2.17. Тестирование гемолитической активности 55
П.2.18. Тестирование влияния холестерина 55 И.
2.19. Фракционирование клеток 56 П.2.20. Определение Р-галактозидазной активности 56 И.
2.21. Экспрессия и очистка до гомогенного состояния рекомбинантного белка N6His-HlyIIR. 56
П.2.22. Электрофорез в ПААГ 57
П.2.23. Тестирование связывания N6His-HlyIIR с ДНК 57
Н.2.24. «Фут-принтинг» 58
И.2.25. Реакция удлинения праймера 58
Глава III. Результаты и обсуждение 60
ПІЛ. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II 60
III. 1.1.Получение рекомбинантных гемолитических клонов и их фенотипический анализ 60
III. 1,2.Физическое и делеционное картирование рекомбинантных плазмид 60
III. 1.3. Идентификация гемолизина, кодируемого клонированным фрагментом ДНК 63
III. 1.3.1. Способы идентификации 63
III. 1.3.2. Гибридизационный анализ 64
III. 1.3.3. Идентификация с использованием функциональных и биохимических тестов 64
III. 1.3.4 Гемолизин II и цереолизинподобный гемолизин 72
Ш.2. Некоторые свойства гемолизина II, продуцируемого рекомбинантными клетками Е. coli и В. subtilis 73
Ш.2.1. Оценка молекулярной массы гемолизина II 73
Ш.2.2. Действие гемолизина II на эритроциты различных видов млекопитающих 74
Ш.2.3. Продукция гемолизина II рекомбинантными клетками Е. coli и В. subtilis: локализация, влияние температуры 76
Ш.2.4. Температурная инактивация гемолизина II 79
Ш.З. Анализ нуклеотидной последовательности гена гемолизина. cereus и выведенной аминокислотной последовательности 80
Ш.З Л. Локализация гена гемолизина II в пределах клонированного фрагмента ДНК 80
Ш.3.2. Анализ первичной структуры гена Ыу II 81
Ш.3.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности гемолизина II 85
Ш.3.3.1. Общий заряд белка 85
Ш.З.3.2. Анализ предполагаемого сигнального пептида 86
III.3.3.3. Гомология гемолизина II с а-токсином S. aureus и с другими белками 87
Ш.З.3.4. Участие С-концевой области гемолизина II в обеспечении его гемолитической функции 96
Ш.4. Распространение гемолизина II среди представителей Bacillus цереусной группы 97
Ш.4.1. Тестирование штаммов на присутствие последовательностей ДНК, гомологичных участку, содержащему hlyll 98
Ш.4.2. Тестирование гемолитической активности штаммов 99
III.4.3. Клонирование и идентификация генетической детерминанты гемолизина II В. thuringienssis 102
III.5. Регулятор экспрессии гена гемолизина II В. cereus 107
Ш.5.1. Анализ нуклеотидной последовательности области ДНК, прилежащей к 3-концу гена hlyll: обнаружение hlyllR 108
Ш.5.2. Влияние гена МуІШ на гемолитическую активность, обусловленную экспрессией hlyll 109
Ш.5.3. Анализ выведенной аминокислотной последовательности HlyllR 111
Ш.5.4. Влияние hlyllR на экспрессию р*-галактозидазы, осуществляемую с промоторной области hlyll 113
Ш.5.5. Вьщеление рекомбинантного белка 6HisHlyIIR 114
Ш.5.6. Выявление операторного участка для HlyllR 115
Выводы 119
Литература
