Введение
Обзор литературы 7
Кислород: дыхание и активные формы кислорода (АФК) 7
Кислород и продукты его восстановления 7
Восстановление кислорода до воды в митохондриях 10
Продукты неполного восстановления кислорода 12
Генерация АФК митохондриями 15
Способы изучения генерации АФК митохондриями 16
Объекты исследований 16
Методы регистрации АФК 18
Источники АФК в митохондриях 20
Дыхательные комплексы I-III 20
Другие митохондриальные ферменты 26
Дигидролипоилдегидрогеназа 29
Локализация и функция 29
Структура 31
Редокс-состояния 34
КАБНілипоамид-оксидоредуктазная активность 35
NADH-зависимое востановление других акцепторов электронов 38
Липоамидредуктазная и диафоразная активности - сходства и различия... 39
Генерация АФК 42
Другие активности 43
Антиоксидантные системы в митохондриях 44
АФК - роль в физиологии и патологии 47
Предпосылки настоящего исследования 49
Материалы и методы исследования 51
Материалы 51
Препаративные методы 51
Получение митохондрий сердца крысы 51
Получение митохондрий сердца быка 52
Получение белковой фракции матрикса 53
Получение субмитохондриальных частиц 53
Получение аммоний-чувствительной КАБНЮг-оксидоредуктазы из фракции митохондриального матрикса 54
Получение рекомбинантной ДЛДГ человека 55
Получение препарата а-кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплексов57
Получение восстановленного липоамида 58
Аналитические методы 59
Определение скорости генерации перекиси водорода 59
Определение скорости генерации перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями 60
Определение скорости генерации перекиси водорода амперометрическим методом 62
Определение скорости генерации супероксид-радикала 63
Определение трансгидрогеназной активности 64 Определение NADH: липоамид оксидоредуктазной активности 64
Определение скорости дыхания митохондрий 65
Определение активности а-кетоглутарат- и пируват-дегидрогеназных комплексов 65
МАЛДИ-масс спектрометрический анализ 66
Электрофорез по методу Лэммли 66
Определение концентрации белка 66
Статистическая обработка данных 67
Результаты 68
Получение очищенного препарата КАБНОг-оксидоредуктазы из митохондриального матрикса 68
Идентификация аммоний-чувствительной NADH: О2-оксидоредуктазы из митохондриального матрикса 68
Кинетические параметры ДЛДГ в реакции генерации перекиси водорода 71
Генерация перекиси водорода ДЛДГ в составе -кетоглутарат- и пируватдегидрогеназного комплексов 76
Генерация перекиси водорода интактными митохондриями 79
Генерация перекиси водорода пермеабилизованными митохондриями 82
Проницаемость митохондриальной мембраны для перекиси водорода 83
Распределение Н2О2-генерирующих активностей между мембранной и растворимой фракциями митохондрий 85
Зависимость генерации Н2О2 от концентрации и соотношения NAD+/NADH 87
Зависимость скорости генерации перекиси водорода ДЛДГ от концентрации кислорода 89
Механизм NADH: 02-оксидоредуктазной реакции, катализируемой ДЛДГ 92
Обсуждение результатов 94
NADH-зависимые генераторы АФК в матриксе митохондрий 94
Локализация ДЛДГ в митохондриях 94
Ограниченная проницаемость внутренней мембраны митохондрий для перекиси водорода 96
Дыхание и продукция АФК митохондриями - сравнение потоков электронов 97
Вклад ДЛДГ в продукцию АФК митохондриями 99
Зависимость генерации АФК комплексом I и ДЛДГ от концентрации NADH... 100
Влияние соотношения NAD+/NADH на генерацию АФК митохондриями 102
Зависимость генерации АФК митохондриями от концентрации кислорода 104
Стимуляция продукции АФК ионами аммония 106
Специфичность эффекта ионов аммония 106
Механизм активирующего влияния аммония на генерацию перекиси водорода ДЛДГ 108
О возможной роли ДЛДГ в продукции АФК в физиологических и патологических условиях 109
Выводы 113
Список цитируемой литературы
