Введение
2. Обзор литературы
2.1 Субстраты ламинариназ и фукоиданаз 10
2.2 Фукоиданы 10
2.3 Фукоиданы с главной цепью, состоящей из -13-связанных остатков сульфатированной фукозы 14
2.4 Фукоиданы, основная цепь которых состоит из чередующихся 13- и 14-связанных остатков сульфатированной -L-фукозы 16
2.5 Фукоиданы, представляющие собой сульфатированные галактофуканы или более сложные гетерополисахариды 18
2.6 Фукансульфаты иглокожих 22
2.7 Ламинараны 24
2.8 Ферменты, катализирующие трансформацию полисахаридов бурых водорослей 26
2.9 13--D-Глюканазы 27
2.10 Фукоиданазы 35
3. Материалы и методы 47
3.1 Биологическое сырье и реактивы 47
3.2 Культивирование бактерий 47
3.3 Определение концентрации белка 48
3.4 Определение восстанавливающих сахаров 48
3.5 Определение общих сахаров 48
3.6 Определение активности ферментов 48
3.7 Метод поиска продуцентов фукоиданаз среди бактерий 50
3.8 Выделение ферментов 50
3.9 Электрофорез белков 3.10 Определение рН оптимума ферментов 55
3.11 Определение температурного оптимума ферментов 55
3.12 Определение температурной стабильности ферментов 56
3.13 Определение влияния ионов двухвалентных металлов на активность ферментов 56 3.14 Выделение геномной ДНК бактерии F. algae 56
3.15 Установление последовательностей нуклеотидов в геномной ДНК бактерии F. algae 56
3.16 Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей 56
3.17 Получение генетических конструкций, кодирующих фукоиданазы из бактерии F. algae 57
3.18 Клонирование и секвенирование плазмидной ДНК, содержащей вставки генов, кодирующих фукоиданазы 58
3.19 Оптимизация экспрессии рекомбинантных фукоиданаз в штаммах E. coli 59
3.20 Получение и анализ продуктов ферментативного гидролиза полисахаридов 60
3.21 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 62
3.22 Определение содержания сульфатных групп 62
3.23 Дезацетилирование фукоиданов 63
3.24 Десульфатирование фукоиданов 63
3.25 Определение моносахаридного состава полисахаридов 63
3.26 Масс-спектрометрия 63
3.27 ЯМР-спектроскопия 64
4. Результаты и их обсуждение 65
4.1 13-b-D-Глюканазы (Ламинариназы) 65
4.1.1 13-b-D-Глюканаза вьетнамской промысловой мидии Perna viridis 65
4.1.2 13-b-D-глюканаза моллюска Южно-Китайского моря Tapes literata 80
4.1.3 13--D-глюканазa из кристаллического стебелька моллюска Mizuhopecten yessoensis 90
4.1.4 13--D-Глюканаза из неоплодотворенных яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius 93
4.1.5 13--D-Глюканаза из печени Littorina sitkana 98
4.2 Фукоиданазы 105
4.2.1 Метод поиска ферментов, деградирующих фукоидан 105
4.2.2 Фукоиданазы из печени моллюска Littorina sitkana 108
4.2.3 Фукоиданаза из морского моллюска Lambis sp. 116
4.2.4 Фукоиданаза из морской бактерии Formosa algae 124
4.2.5 Рекомбинантные фукоиданазы из морской бактерии Formosa algae 132
4.2.5.1 Рекомбинантная фукоиданаза FFA2 136
4.2.5.2 Рекомбинантная фукоиданаза FFA1 147
Заключение 153
Выводы 156
Список литературы
