Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1 Классификация хантавирусов 12
1.2 Биохимические и физиологические особенности хантавирусной инфекции 13
1.3 Эпидемиология хантавирусов 16
1.4 Молекулярная организация генома хантавирусов 18
1.5 Жизненный цикл хантавирусов 20
1.6 Репликация и транскрипция хантавирусов 21
1.7 Хантавирусные белки
1.7.1 Нуклеокапсидный белок 23
1.7.2 Гликопротеины 29
1.7.3 РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) 32
1.8 Rab белки 34
ГЛАВА 2. Материалы и методы 37
2.1 Методы создания рекомбинантных генетических конструкций, кодирующих кДНК
генов нуклеокапсидных белков хантавирусов 37
2.1.1. Реакция BP-рекомбинации для клонирования кДНК нуклеокапсида хантавирусов в плазмидный вектор pDONR221 37
2.1.1.2 Реакция LR-рекомбинации 38
2.1.2 ПЦР-скрининг колоний 39
2.1.4 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК) 40
2.1.5 Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК 40
2.1.6 Методы работы с прокариотическими клетками 41
2.1.6.1 Трансформация бактериальных клеток 41
2.2 Методы работы с эукариотическими клетками 42
2.2.1 Создание рекомбинантных лентивирусов 43
2.2.2 Определение вирусного титра 44
2.3 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки (трансфекция и вирусная трансдукция) 45
2.3.1 Перенос нуклеиновых кислот в культуру клеток с помощью реагента TurboFect (трансфекция) 45
2.3.2 Трансдукция клеток A549 рекомбинантными лентивирусами 46
2.4 Методы анализа синтеза рекомбинантных белков in vitro 47
2.4.1. Иммунoфлуоресцентный анализ 47
2.4.2. Анализ синтеза белков методом иммуноблотинга 48
2.4.3 Исследование биосинтеза цитокинов и хемокинов по технологии xMAP Luminex 50
2.5 Методы исследования экспрессии генов 50
2.5.1 Выделение тотальной РНК из культур клетoк 50
2.5.2 Pеакция oбpатнoй тpанскpипции 51
2.5.3 Количественная оценка транскрипции мРНК генов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени 51
ГЛАВА 3. Результаты исследований 54
3.1 Создание плазмидных лентивирусных конструкций, кодирующих кДНК генов нуклеокапсидных белков хантавирусов 54
3.2 Получение рекомбинантных лентивирусов, экспрессирующих нуклеокапсидные белки хантавирусов 57
3.3 Исследование внутриклеточного транспорта нуклеокапсидных белков хантавирусов 60
3.4 Активация противовирусных механизмов при хантавирусных инфекциях 85
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 91
Выводы 99
Список использованной литературы 100
