Введение
1. Обзор литературы 12
1.1.Чувствительность нейральных стволовых клеток к действию ионизирующего излучения и цитотоксических препаратов 12
1.1.1 Чувствительность нейральных стволовых клеток к действию ионизирующего излучения 13
1.1.2 Механизмы повреждения ЦНС при облучении мозга, несвязанные с нарушением нейрогенеза в гиппокампе 15
1.1.3 Образование и репарация повреждений ДНК в облученных клетках 18
1.1.4 Роль активных метаболитов кислорода и азота в повреждении нейральных стволовых клеток при действии ионизирующего излучения.
1.1.5. Повреждение нейральных стволовых клеток при действии химиотерапевтических препаратов 27
1.1.6. Разработка полимерных форм противоопухолевых препаратов для пролонгирования их действия и снижения неспецифической токсичности. 28
1.2 Поиск перспективных нейропротекторов для снижения уровня повреждений нейральных стволовых клеток после токсических воздействий 31
1.2.1.Исследование возможности использования антиоксидантов в защите НСК при действии излучения 32
1.2.2 Использование трансплантации НСК для стимуляции регенерации клеток головного мозга после токсических воздействий 36
1.2.3. Потенциал мезенхимальных стволовых клеток для стимуляции процессов восстановления тканей и регенерации НСК после радиационных поражений 37
2. Материалы и методы 51
2.1.Выделение НСК и МСК из костного и головного мозга и жировой ткани мышей 51
2.1.1 Выделение НСК 51
2.1.2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из головного мозга мышей (МСК-ГМ) 51
2.1.3. Выделение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга мышей (МСК-КМ)
2.1.4. Выделение МСК из жировой ткани 52
2.2.Культивирование клеток 53
2.2.1.Культивирование НСК 53
2.2.2. Культивирование МСК-ГМ 54
2.2.3. Культивирование МСК-КМ 55
2.2.4. Культивирование МСК -ЖТ 55
2.2.5. Культивирование клеток линии феохромоцитомы крысы PC12
2.3. Иммуноцитохимический анализ специфических антигенов НСК мыши 56
2.4. Фенотипирование НСК с помощью проточной цитометрии 57
2.5. Облучение клеток 59
2.6. Подсчет НСК в камере Горяева 59
2.7. Анализ клоногенной активности. 59
2.10. Индукция дифференцировки НСК мыши [179] 61
2.11. Окрашивание НСК антителами к фосфорилированному гистону Н2АХ c помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии 61
2.12. Исследование защитного действия антиоксидантов на НСК 63
2.13. Получение и характеистика ПФЭ на основе биосовместимого биодеградируемого сополимера ПЛГА . 63
2.14. Исследование противоопухолевой активности ПФЭ в сравнении с этопозидом in vivo 64
2.15. Приготовление среды, кондиционированной МСК, и ее характеристика
2.15.1. Получение кондиционированной среды МСК-КМ, МСК-ГМ, МСК-ЖТ, для анализа влияния на дифференцировку клеток линии РС12 65
2.15.2. Получение кондиционированной среды МСК-ЖТ для исследования ее влияния на НСК и защитного действия кондиционированной среды после облучения и действия этопозида и ПФЭ. 65
2.15.3. Определение уровня цитокинов в кондиционированной среде МСК-ЖТ 65
2.15.4. Определение активности нейротрофинов среде, кондиционированной МСК, по ее влиянию на индукцию дифференцировки клеток линии РС12 [183] 66
2.16. Исследование защитного действия кондиционированной среды -МСК после облучения НСК 66
2.17. Микроскопия 67
2.18. Статистическая обработка. 67
3. Результаты исследований 68
3.1. Исследование чувствительности НСК мыши к действию -излучения. 68
3.1.1. Характеристика НСК мыши. 68
3.1.5. Анализ содержания фокусов гистона Н2АХ в НСК после облучения 71
3.1.2.Изучение зависимости выживаемости НСК мыши от дозы -излучения. 74
3.1.3. Исследование влияния облучения на способность НСК к дифференцировке 79
3.1.4. Исследование радиозащитного действия антиоксидантов на развитие радиационных повреждений НСК in vitro 83
3.2. Исследование противоопухолевой активности полимерной формы этопозида в сравнении с действием свободного этопозида 88
3.2.1. Изучение специфической активности полимерной формы противоопухолевого препарата этопозида in vitro 88
3.2.1. Изучение специфической активности полимерной формы противоопухолевого препарата этопозида in vivo 91
3.2.2. Изучение токсичности свободной и полимерной формы этопозида в отношении НСК. 93
3.3. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК 95
3.3.1. Получение кондиционированной среды МСК 95
3.3.2. Исследование активности нейротрофинов, в среде, кондиционированной МСК из разных тканей мыши, с использованием клеток феохромоцитомы крысы линии РС12. 95
3.3.2.Определение уровня цитокинов в КС МСК-ЖТ 97
3.3.3. Изучение влияния КС МСК из жировой ткани мыши на выживаемость НСК. 98
3.3.4. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК из жировой ткани мыши, на НСК при действии -излучения. 99
3.3.5. Изучение нейропротекторной активности факторов, секретируемых МСК из жировой ткани мыши, на НСК при действии этопозида 104
4. Заключение 106
5. Выводы 113
Список литературы
