Введение
2. Обзор литературы Транскриптомика и протеомика в исследованиях индуцированной дифференцировки лейкозных клеток 14
2.1 Транскриптомные и протеомные методы – методологическая платформа для исследования индуцированной дифференцировки. 18
2.1.1 Транскриптомные методы 18
2.1.2 Протеомные методы 21
2.2 Дифференциальное профилирование в исследованиях экспрессии поверхностных маркеров, посттрансляционных модификаций и различных направлений дифференцировки лейкозных клеток . 24
2.2.1 Дифференциальное профилирование для сравнения физиологической и индуцированной дифференцировки 25
2.2.2 Дифференциальное профилирование для сравнения различных направлений дифференцировки лейкозных клеток 25
2.2.3 Дифференциальное профилирование для исследования резистентности лейкозных клеток 27
2.2.4 Дифференциальное профилирование для исследования посттрансляционных модификаций в лейкозных клетках 29
2.2.5 Дифференциальное профилирование для исследования поверхностных маркеров лейкозных клеток 30
2.3. Дифференциальное профилирование в исследованиях механизма действия альтернативных ATRA дифференцирующих и противоопухолевых препаратов 31
2.3.1 5-аза-2 дезоксицитидин 34
2.3.2 Адафостин 35
2.3.3 Ловастатин 36
2.3.4 Генистеин 36
2.3.5 Оксид мышьяка 37
2.4. Дифференциальное профилирование в исследованиях путей сигнальной трансдукции в процессе индуцированной дифференцировки лейкозных клеток 38
2.4.1 Транскрипционный фактор HOXA9 39
2.4.2 Сигнальный путь инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1) 40
2.4.3 Сигнальный путь MAPK
2.5. Системная биология индуцированной дифференцировки лейкозных клеток 42
2.6. Заключение 47
3. Материалы и методы 49
3.1 Индукция клеток линии HL-60 к дифференцировке 49
3.1.1 Культивирование клеток линии HL-60 49
3.1.2 Определение чувствительности клеток линии HL-60 к транс-ретиноевой кислоте (ATRA) с помощью МТТ-теста. 49
3.1.3 Определение поверхностных маркеров дифференцировки клеток линии HL-60 методом проточной цитофлуориметрии. 50
3.1.4 Индукция клеток линии HL-60 к дифференцировке и подготовка клеточного материала для протеомного и транскриптомного анализа . 51
3.2 Полногеномный транскриптомный анализ клеток линии HL-60 в процессе ATRA индуцированной дифференцировки 52
3.2.1 Выделение общей РНК из клеток линии HL-60 в процессе дифференцировки и определение качества выделенной общей РНК. 52
3.2.2 Обратная транскрипция РНК в кДНК, амплификация кДНК и включение флуоресцентно меченых нуклеотидов в процессе синтеза кРНК, очистка меченой кРНК. 52
3.2.3 Оценка концентрации и качества кРНК 54
3.2.4 Полногеномный транскриптомный анализ кРНК на экспрессионных чипах Agilent 54
3.2.5 Первичная обработка транскриптомных данных 55
3.2.5 Функциональная классификация дифференциально экспрессирующихся генов 56
3.3 Протеомный анализ клеток линии HL-60 в процессе дифференцировки 56
3.3.1 Экстракция белков клеток линии HL-60 для последующего протеомного анализа 56
3.3.2 Гидролитическое ферментативное расщепление белков клеток линии HL-60 56
3.3.3 Общее протеомное профилирование клеток линии HL-60 в процессе
дифференцировки с помощью масс спектрометра высокого разрешения LTQ Orbitrap Velos. 57
3.3.4 Относительный количественный анализ масс спектрометрических данных без использования изотопных меток в ПО SPIRE. 58
3.4 Моделирование процесса дифференцировки клеток линии HL-60 с использование данных транскриптомного и протеомного профилирования в ПО geneXplain 60
3.4.2 Поиск потенциальных регуляторных транскрипционных факторов с использованием базы данных TRANSFAC. 61
3.4.2 Построение регуляторных сетей с использованием базы данных TRANSPATH.
3.5 Направленная масс-спектрометрия: целевой масс-спектрометрический метод высокого разрешения (PRM) и метод мониторинга выбранных реакций (SRM метод) 63
3.5.1 Гидролитическое расщепление белков с помощью концентрирующих фильтров 63
3.5.2 Панорамный масс-спектрометрический анализ для создания библиотеки спектров в ПО Skyline. 64
3.5.3 Целевой масс-спектрометрический анализ высокого разрешения (PRM) 64
3.5.4 Количественный анализ белков клеток линии HL-60 с помощью тройного
квадрупольного масс спектрометра в режиме мониторинга выбранных реакций (SRM).
4. Результаты 72
4.1 Основные результаты работы 72
4.1.1 Определение оптимальной концентрации ATRA для индукции гранулоцитарной дифференцировки. 74
4.1.2 Подтверждение гранулоцитарной ATRA-индуцированной дифференцировки клеток линии HL-60. 77
4.1.3 Результаты полногеномного транскриптомного анализа и функциональная аннотация дифференциально экспрессирующихся генов в ходе индуцированной ATRA дифференцировки клеточной линии HL-60 79
4.1.4 Панорамный количественный протеомный анализ ATRA-индуцированной дифференцировки клеток линии HL-60 83
4.1.5 Моделирование процесса ATRA-индуцированной дифференцировки клеток линии HL6 в ПО geneXpain 89
4.1.6 Сопоставление молекул модельной схемы с транскриптомными и протеомными данными и количественный протеомный анализ молекул, задействованных в дифференцировке клеток линии HL-60. 96
4.1.6.1 Сопоставление молекул модельной схемы с данными полногеномного транскриптомного анализа и результатами панорамного масс-спектрометрического анализа. 97
4.1.6.2 Результаты направленной масс-спектрометрии 99
4.1.6.3 Профили экспрессии на уровне мРНК и белков для LYN, FGR, VAV1, PRAM1. 120
5. Обсуждение результатов 12
5.1 Дифференциально экспрессирующиеся белки и транскрипты – основа для формирования зрелого фенотипа гранулоцитов 124
5.1.1 Биологическая значимость белков, дифференциально экспрессирующихся во всех
временных точках по результатам анализа в SPIRE 125
5.1.2 Совокупность молекул PRAM1, FGR, LYN, VAV1, демонстрирующих согласованное увеличение экспрессии, может играть важную роль в ATRA индуцированной дифференцировке 129
5.2 Модельная схема ATRA-индуцированной дифференцировки клеток линии HL-60,
построенная в ПО geneXplain. 133
5.2.1 PARP1 –регулятор ATRA-индуцированной дифференцировки клеток линии HL 60 134
5.2.2 Дивергенция гранулоцитарного и моноцитарно-макрофагального направления дифференцировки 135
5.2.3Модельная схема ATRA-индуцированной дифференцировки может представлять вариант преодоления последствий делеции опухолевого супрессора p53 136
6.Заключение 141
7.Выводы 143
8. Список цитируемой литературы 145
