Введение
1. Вакцины 11
1.1. Типы вакцин 12
1.2. Съедобные вакцины .13
1.2.1. Критерии мукозных вакцин на основе трансгенных растений 14
1.2.2. Съедобные вакцины на основе растительного материала 15
1.2.3. Вакцина против гепатита В 16
2. Основы функционирования мукознои иммуной системы человека 19
3. Вирусный гепатит в 22
3.1. Краткая характеристика вирусного гепатита В 22
3.2. Структура генома гепатита В 23
3.3. Строение и функции внешней оболочки вируса гепатита В 27
3.4. Репликация и размножение вируса гепатита В в гепатоцитах 28
4. Получение трансгенных организмов 31
4.1. Генетическая трансформация растительных объектов 31
4.2. Методы получения трансгенных растений 38
4.2.1. Агробактериальная трансформация . 38
4.2.2.Трансформация методом микроинъекций 46
4.2.3. Электропорация 47
4.2.4. Биобаллистическая трансформация 48
4.2.5. Трансформация с помощью липосом— 48
4.3. Агробактериальная трансформация растений томата 49
4.4. Способы генетической модификации животных ..51
4.5. Выводы из обзора литературы, постановка цели и задач
исследования 52
Экспериментальная часть 55
5. Объекты и методы исследования 55
5.1. Растительный материал 55
5.2. Приготовление сред для проращивания семян и пересадки трансформированых проростков 55
5.3. Обработка и проращивание семян 55
5.4. Бактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens используемый для трансформации растений томата . 56
5.5. Культивирование Agrobactetium tumefaciens 59
5.6. ПНР анализ бактериальной ДНК колоний 60
5.7. Трансформация эьссплантов и пересадка их на селективную среду 61
5.8. Селекция и адаптация эксплантов 61
5.8.1. Селективный отбор проростков на среде с канамицином и пересадка их в сосуды с влажной фильтровальной бумагой 61
5.8.2. Адаптация проростков, прошедших селекцию на канамицине, к условиям внешней среды 62
5.8.3. Пересадка проростков в почвенную среду 62
5.9. Трансформация растений, выращенных в почве 62
5.10 Высадка растений в теплицу и уход за ними 63
5.11. Сбор и обработка плодов 63
5.12. ПНР анализ ДНК, выделенного из листьев и плодов растений, прошедших селекцию на канамицине 64
5.13. ИФА экстрактов полученных из листьев и плодов трансформированных растений томата 65
5.14. Использованные реактивы. 66
6. Результаты исследований ...67
6.1. ПНР анализ плазмидной ДНК, выделенной из бактериальных колоний 67
6.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности селективного гена nptll 68
6.2.1. Получение проростков растений томата 68
6.2.2. Трансформация эксплантов ..69
6.2.3. Отбор трансформированных растений на селективной среде 69
6.3. Адаптация растений, прошедших селекцию на канамицине, к условиям внешней среды 71
6.3.1. Адаптация к внешней атмосфере 71
6.3.2. Адаптация к почвенной среде 72
6.4. Высадка растений в грунт и уход за ними 73
6.5. Молекулярно-генетические доказательства трансформации 75
6.5.1. ПЦР-анализ плодов трансформированных растений томата поколения То 76
6.5.2. Иммуноферментный анализ 79
6.5.2.1. Иммуноферментный анализ листьев растений томата поколения То 79
6.5.2.2. Иммуноферментный анализ плодов растений томата поколения То 83
6.5.2.3. Иммуноферментный анализ листьев растений томата поколения Ті 86
6.5.2.4. Подтверждающий иммуноферментный анализ экстрактов плодов растений томата поколения| 89
Обсуждение 98
Заключение 105
Выводы . 107
Литература
