Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Общая характеристика митохондриального генома высших растений. 10
1.1.1 Особенности структурной организации генома растительных митохондрий 10
1.1.2 Кодирующие последовательности мт-генома высших растений 15
1.1.3 Перенос нуклеотидных последовательностей между органеллами19
1.2 Плазмидоподобные митохондриальные днк высших растений 25
1.2.1 Исследования репликации ппДНК 27
1.2.2 Функциональная роль ппДНК в растительных митохондриях 30
1.2.3 Происхождение ппДНК 34
1.3 Исследования импорта нуклеиновых кислот в митохондрии 37
1.3.1 Роль импорта нуклеиновых кислот в реализации генетических процессов в митохондриях на примере импорта РНК. 41
1.3.2. Исследование механизмов импорта тРНКу различных организмов 47
1.3.2.1 Участие митохондриального белкового аппарата импорта в транслокации РНК у Saccaromyces cerevisae и млекопитающих. 47
1.3.2.2 Прямой импорт тРНК у трипаносоматид 51
1.3.2.3 Исследования механизма импорта РНК у растений 54
2. Материалы и методы 59
2.1 Выделение растительных митохондрий 59
2.2 Функциональное тестирование изолированных растительных митохондрий 59
2.3 Молекулярно-биологические методы, использованные при анализе днк и клонировании генетических конструкций для импорта 60
2.3.1 Амплификация ДНК в полимеразной цепной реакции (ПНР) 60
2.3.2 Трансформация бактерий методом электропорации 61
2.3.3 Выделение плазмидной ДНК и ее ферментативная обработка 62
2.3.4 Электрофоретический анализ ДНК и элюцияДНК из агарозного геля 62
2.4 Радиоактивно меченые субстраты днк, использованные для импорта в митохондрии 63
2.5 Создание генетических конструкций для импорта днк в митохондрии и транскрипции 64
2.6 Эксперименты по импорту днк в митохондрии 67
2.6.1 Импорт ДНК в изолированные митохондрии в стандартных условиях 67
2.6.2 Получение митопластов 68
2.6.3 Обработка митохондрий окислительными агентами 68
2.6.4 Обработка митохондрий трипсином 68
2.6.5 Обработка митохондрий антителами 69
2.7 Анализ транскрипции импортированных в митохондрии последовательностей діж методом обратной транскрипции/пцр 69
2.8 Анализ транскрипции и репликации импортированных в митохондрии последовательностей днк методом синтеза рнк и днк inorganello 70
2.9 Получение субмитохондриальных фракций 71
2.10 Электрофорез митохондриальных белков в полиакриламидном геле (пааг) и радиоавтография геля 72
2.11 Southern-western и northern-western блоттинг 73
2.12 Транскрипция in vitro 74
3. Результаты и их обсуждение 75
3.1 Транслокация днк в растительные митохондрии. 75
3.1.1 Определение условий импорта ДНК в растительные митохондрии 75
3.1.2 Импорт ДНК происходит через интактные внешнюю и внутреннюю митохондриальные мембраны 79
3.2 Определение специфичности импортируемой в растительные митохондрии днк 82
3.3 Транскрипция и репликация импортируемой в митохондрии днк 84
3.3.1 Клонирование векторов для анализа экспрессии импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК 86
3.3.2 Анализ транскрипции импортированной в митохондрии экзогенной ДНК методами ОТ-ПЦР и Southern-блот гибридизации 88
3.3.3 Анализ репликации импортированной в растительные митохондрии экзогенной ДНК методом Southern-блот гибридизации 93
3.4 Исследование механизма импорта днк в растительные митохондрии 94
ЗАЛ Активность процесса транслокации ДНК 94
3.4.2 Исследование участия в процессе импорта ДНК митохондриальных белков методами Southern-Western-блот гибридизации и «ковалентных сшивок» 97
3.4.3 Импорт ДНК в митохондрии и явление митохондриальной мегапроницаемости 102
3.4.4 Исследование участия в процессе транслокации ДНК митохондриалъного порина. 107
Заключение 115
Выводы 119
