Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Туберкулез: древнее и современное заболевание человечества 14
1.2. Структура генома М. tuberculosis 17
1.3. Эволюция М. tuberculosis complex 21
1.4. Реконструкция ранней эволюции М. tuberculosis complex 27
1.5. Популяционная структура М tuberculosis и филогенетические построения 32
1.6. Молекулярно-эпидемиологические маркеры М. tuberculosis 37
1.7. Генетическое семейство Beijing вида М. tuberculosis 42
1.8. Развитие лекарственной устойчивости М. tuberculosis как форма микроэволюции 44
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Штаммы М. tuberculosis и определение лекарственной устойчивости 53
2.2. Определение мутаций устойчивости к ПТП 54
2.2.1. Определение мутаций в katG315 54
2.2.1.1. Определение мутаций в katG315 методом ПЦР-ПДРФ 54
2.2.1.2. Определение мутаций в katG315 методом МАС-ПЦР 56
2.2.2. Определение мутаций в гроВ методом МАС-ПЦР 57
2.2.2.1. Вариант простой МАС-ПЦР 57
2.2.2.2. Вариант двушаговой гнездной аллель-специфической ПЦР 59
2.2.3. Определение мутаций в етЬВЗОб 60
2.2.3.1. Определение мутаций в етЬВЗОб методом ІЩР-ПДРФ 60
2.2.3.2. Определение мутаций в етЬВЗОб методом МАС-ПЦР 62
2.3. Геномная дактилоскопия штаммов М. tuberculosis 62
2.3.1. Сполиготипирование 62
2.3.2. IS6770-RFLP типирование 64
2.3.3. VNTR типирование 65
2.3.4. Типирование с использованием инвертированной IS61J0-TQjp 67
2.4. Анализ IS1547 68
2.5. Анализ длины гена Rv3135 69
2.6. Анализ структуры локуса NTF 70
2.7. Сбор данных по VNTR локусам и создание глобальной базы данных VNTR штаммов Beijing 70
2.8. Статистический анализ 72
2.9. Расчет генетического расстояния между географическими популяциями 72
2.10. Анализ исторических связей между географическими регионами 74
Глава 3. Анализ филогенетически значимых IS- и РРЕ-элементов генома штаммов Mycobacterium tuberculosis 75
3.1. Филогенетический анализ штаммов Beijing на основе IS6110 75
3.2. Анализ полиморфизма IS1547/IS6110 78
3.3. Анализ полиморфизма генаRv3135-PT>E 82
3.4. Анализ локуса NTF 83
3.5. Генотипирование штаммов М. tuberculosis, выделенных в Китае 83
3.6. Применение инвертированной 6110-ПНР для генотипирования М. tuberculosis и детекции генотипа Beijing 87
3.7. «Право-левое» сполиготипирование 90
Глава 4. Молекулярные механизмы и генотипическая детекция лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis 95
4.1. Анализ мутаций в katG315 96
4.2. Анализ мутаций в «горячем участке» гроВ (кодоны 516,526,531) 97
4.3. Анализ мутаций в етЪВЗОб 100
4.4. Анализ распределения основных мутаций устойчивости 103
Глава 5. Применение локусов VNTR для оценки генетического разнообразия и эволюции М. tuberculosis 105
5.1. Оценка нового поколения VNTR маркеров для высокоразрешающего генотипирования 105
5.1.1. Анализ штаммов с различными профилями 1S6110-RFLP (выборка 1) 105
5.1.2. VNTR генотипирование штаммов Beijing двух преобладающих IS6110-KFLV кластеров 112
5.2. Глобальная база данных MIRU-VNTR и филогеографический анализ генотипа Beij ing 116
Глава 6. Обсуждение 126
6.1. Древние и современные штаммы Beijing: концепция, эволюция и диагностика 126
6.2. Изменения в генах резистентности как форма микроэволюции генома М. tuberculosis и генотипическое определение лекарственной устойчивости 134
6.3. Редуцированная схема VNTR-типирования российских штаммов Beijing и анализ кластера Beijing/BO 142
6.4. Филогеография генотипа Beijing в контексте коэволюции Н. sapiens и М. tuberculosis 148
Выводы 161
Список использованной литературы 163
Приложения 209
