Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 18
1.1. Амидазы - нитрилгидролизующие ферменты 18
1.1.1. Применение L- и D-энантиомеров аминокислот 19
1.1.2. L-селективные аминокислотные амидазы 22
1.1.3. D-селективные аминокислотные амидазы 25
1.2. Биотрансформация субстратов иммобилизованными амидазами 29
1.2.1. Иммобилизация клеток с амидазной активностью 29
1.2.2. Иммобилизация выделенных амидаз 1.3. Факторы, влияющие на стереоселективность ферментов 32
1.4. Энантиоселективная биотрансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила. 36
1.5. Биотрансформация фенилаланинамида 41
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий 43
2.3. Среды и субстраты для культивирования 46
2.4. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов 46
2.5. Выделение амидазы 47
2.6. Иммобилизация 49
2.7. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов 50
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция 51
2.9. Секвенирование ДНК 53
2. 10. Статистическая обработка 54
ГЛАВА 3. Исследование культуральных и стереоселективных свойств штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 56
3.1. Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации 0,Ь-лактамида
3.2. ПЦР-анализ генов D-аминокислотных амидаз 57
3.3. Идентификация выделенных культур 59
3.4. Влияние источника углерода на рост и амидазную активность бактерий 63
3.5. Влияние источника азота на рост и амидазную активность бактерий.. 65
3.6. Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз 67
ГЛАВА 4. Стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 69
4.1. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном 69
4.2. Стереоселективные свойства амидаз, иммобилизованных различными методами 76
4.3. Влияние температуры на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз 81
4.4. Влияние рН на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз 84
ГЛАВА 5. Биотрансформация ароматических амидов аминокислот 86
5.1. Биотрансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила 86
5.1.1. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу D,L-фенилглицинонитрила 86
5.1.2. Индукция нитрилгидролизующей активности штамма Rhodococcus rhodochrous 4-1 88
5.1.3. Трансформация 0,Ь-фенилглицинонитрила изолированной амидазойі?. rhodochrous 4-1 90
5.1.4. Влияние температуры на активность и стереоселективность амидазы R. rhodochrous 4-1 в реакции гидролиза D,L-фенилглицинонитрила 91
5.1.5. Влияние иммобилизации нитрилгидратазы и амидазы
R. rhodochrous 4-Х на стереоселективность реакции 91
5.2. Биотрансформация L-фенилаланинамида 93
Заключение 96
Выводы 102
Список литературы 1
