ОГЛАВЛЕНИЕ
Список используемых сокращений ................................................................. 5
ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................... 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................ 17
1.1. Аргонавты эукариот ................................................................................. 18
1.2. Аргонавты прокариот ............................................................................... 26
1.2.1. Структура длинных аргонавтов. Связывание гида в MID и PAZ
доменах ......................................................................................................... 28
1.2.2. Длинные активные аргонавты подгруппы long-A ........................... 34
1.2.2.1. Механизм катализа ........................................................................... 34
1.2.2.2. Защитная функция активных аргонавтов в клетках бактерий ....... 37
1.2.2.3. Функции активных аргонавтов в репликации ДНК ....................... 41
1.2.2.4. Разнообразие активных аргонавтов ................................................ 43
1.2.3. Длинные неактивные аргонавты подгруппы long-B ....................... 44
1.2.4. Длинные неактивные аргонавты подгруппы long-C ......................... 49
1.3. Короткие аргонавты прокариот............................................................... 51
1.3.1. Клада S1B ........................................................................................... 53
1.3.2. Клада S2A ........................................................................................... 55
1.3.3. Клада S2B ........................................................................................... 57
1.3.4. Механизмы активации белков-партнеров коротких аргонавтов ...... 58
1.4. Заключение ............................................................................................... 60
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ........................................................................ 62
2.1. Бактериальные штаммы ........................................................................... 62
2.2. Плазмиды .................................................................................................. 62
2.3. Питательные среды и антибиотики ......................................................... 63
2.4. Получение и трансформация химически компетентных клеток............ 64
2.5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами .......................................... 65
2.5.1. Электрофорез в агарозном геле ......................................................... 65
2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле .......................................... 65
3
2.5.3. Выделение РНК из полиакриамидного геля ..................................... 66
2.5.4. Выделение ДНК из агарозного геля .................................................. 67
2.5.5. Переосаждение нуклеиновых кислот ................................................ 67
2.5.6. Получение генетических конструкций................................................. 68
2.5.6.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) ............................................. 68
2.5.6.2. Лигирование ..................................................................................... 68
2.5.6.3. Реакция Гибсона............................................................................... 69
2.5.7. Выделение плазмидной и геномной ДНК из клеток E. coli ................ 69
2.5.8. Выделение тотальной РНК из клеток E. coli........................................ 69
2.5.9. Получение плазмид CmeSPARDA и вариантов NbaSPARDA .......... 70
2.6. Методы работы с белками ........................................................................ 71
2.6.1. Электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли........... 71
2.6.2. Экспрессия и очистка комплексов NbaSPARDA и CmeSPARDA .... 72
2.7. Методы исследования активности SPARDA in vitro .............................. 74
2.7.1. Изучение нуклеазной активности SPARDA ...................................... 74
2.7.2. Изучение многораундовой кинетики расщепления субстратов
комплексом NbaSPARDA ............................................................................. 75
2.7.3. Определение молекулярной массы и олигомерного состояния
SPARDA ........................................................................................................ 75
2.7.4. Применение SPARDA в тест-системе ............................................... 77
2.8. Методы исследования активности SPARDA in vivo ............................... 77
2.8.1. Исследование действия SPARDA на чужеродную плазмиду ........... 77
2.8.2. Анализ деградации ДНК и РНК в клетках E. coli ............................. 78
2.8.3. Микроскопия клеток в присутствии чужеродной плазмиды ........... 79
2.8.4. Изучение антифагового действия SPARDA ...................................... 80
2.8.5. Изучение антифагового действия AmAgo и Agap-HEPN ................. 83
2.8.6. Микроскопия клеток во время фаговой инфекции для AmAgo и Agap
HEPN 84
2.8.7. Выделение РНК, ассоциированных с NbaSPARDA и тотальной РНК
из клеток E. coli ............................................................................................ 85
4
2.8.8. Получение и анализ библиотек коротких РНК и тотальной РНК .... 86
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................. 88
3.1. Структура NbaAgo, CmeAgo и их белков-партнеров ............................. 88
3.2. Выделение комплексов NbaSPARDA и CmeSPARDA ............................ 92
3.3. Нуклеазная активность SPARDA ............................................................ 94
3.4. Роль DREN-домена в нуклеазной активности SPARDA ........................ 98
3.5. Роль MID-домена в активации SPARDA ................................................. 99
3.6. Специфичность аргонавта к 5'-концу и длине гида ............................. 101
3.7. Оптимальные условия для нуклеазной активности SPARDA ............. 104
3.8. Олигомерное состояние SPARDA при связывании гида и мишени .... 107
3.9. Использование SPARDA в тест-системе для детекции ДНК ............... 109
3.10. Многораундовое расщепление субстратов комплексом NbaSPARDA 111
3.11. Активация SPARDA чужеродной плазмидой ..................................... 113
3.12. Расщепление ДНК системой SPARDA в клетках бактерий ............... 119
3.13. Влияние SPARDA на целостность бактериальных клеток ................ 122
3.14. Анализ нуклеиновых кислот, ассоциированных с NbaSPARDA в
клетках ........................................................................................................... 123
3.15. Активация SPARDA при фаговой инфекции ...................................... 129
3.16. Антифаговый эффект при кооперации long-A аргонавта AmAgo и
нуклеазы Agap-HEPN.................................................................................... 136
3.17. Заключение ........................................................................................... 143
ВЫВОДЫ ......................................................................................................... 148
БЛАГОДАРНОСТИ ....................................................................................... 149
4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ......................................................................... 150
ПРИЛОЖЕНИЕ .............................................................................................. 165
