Введение
ГЛАВА 1 Криобиосфера как среда обитания микроорганизмов 12
1.1 Вечная мерзлота и криопэги: определение, строение, физико-химические условия 12
1.2 Биоразнообразие бактерий многолетнемерзлых пород 13
1.3 Биоразнообразие прокариот в криопэгах 16
1.4 Характеристика рода psychrobacter 21
ГЛАВА 2 Адаптация прокариот к низким температурам
2.1 Физиологические группы бактерий по отношению к температуре.. 26
2.2 Механизмы адаптации к низкой температуре 27
2.2.1 Изменение структуры и функций компонентов мембраны 28
2.2.2 Синтез белков теплового шока 30
2.2.3 Белки холодового шока 31
2.2.4 Криопротекторы: белки и органические осмолиты 32
2.2.5 Холодоактивные белки 34
2.2.6 Анализ геномов и протеомов психрофилов 35
ГЛАВА 3 Холодоактивные липолитические ферменты 37
3.1 Основные свойства и биологические функции липолитических ферментов 37
3.2 Классификация бактериальных липаз 42
3.3 Особенности структуры холо до активных липолитических ферментов 46
3.4 Продуценты холо до активных липаз 48
3.5 Методы определения активности липаз 51
3.6 Применение холодоактивных липолитических ферментов в биотехнологии экспериментальная часть 55
Глава 4 Материалы и методы исследования 55
4.1 Объекты исследования 55
4.2 Районы исследования 56
4.3 Материалы 58
4.3.1 Штаммы Escherichia coli, вектор и среды для культивирования E.coli 58
4.3.2 Олигонуклеотиды 58
4.4 Микробиологические методы анализа 59
4.4.1 Оценка общей численности микроорганизмов 59
4.4.2 Накопительное культивирование и выделение чистых культур бактерий 60
4.4.3 Микроскопические методы исследования 61
4.4.4 Культивирование P. cryohalolentis 61
4.4.5 Определение липолитической активности 61
4.5 Молекулярно-генетические методы, использованные для изучения микроорганизмов 63
4.5.1 Выделение геномной ДНК 63
4.5.2 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 63
4.5.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов 16SpPHK и филогенетический анализ 64
4.6 Молекулярно-генетические методы, использованные для получения рекомбинантных белков 64
4.6.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 64
4.6.2 Рестрикция 65
4.6.3 Электрофорез ДНК 65
4.6.4 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 65
4.6.5 Лигирование 65
4.6.6 Трансформация клеток Е. coli 65
4.6.7 ПЦР-анализ клонов 66
4.6.8 Выделение плазмидной ДНК из Е. coli 66
4.6.9 Секвенирование ДНК. 66
4.6.10 Конструирование экспрессионных векторов 66
4.7 Биохимические методы исследования 68
4.7.1 Денатурирующий электрофорез белков в ДСН-ПААГ. 68
4.7.2 Оптимизация экспрессии в Е. coli рекомбинантных белков 69
4.7.3 Выращивание рекомбинантных штаммов Е. coli 69
4.7.4 Выделение рекомбинантных белков EstPc, Lip IP с, ND1-ND5, LifPcd23 и LifPcd62 из клеток Е. coli 70
4.7.5 Получение рекомбинантного белка Lip2Pc 71
4.7.6 Рефолдинг рекомбинантного белка Lip2Pc 71
4.7.7 Очистка рекомбинантного белка Lip2Pc 72
4.7.8 Определение концентрации белка 72
4.7.9 Определение липолитической активности рекомбинантных белков 73
4.7.10 Характеристика свойств рекомбинантных белков 73
ГЛАВА 5 Результаты и обсуждение 74
5.1 Криопэги как источник продуцентов холо до активных липолитических ферментов 74
5.1.1 Микробиологическая характеристика исследуемых криопэгов 74
5.1.2 Скрининг на наличие липолитической активности у выделенных микроорганизмов 77
5.1.3 Морфологический и филогенетический анализ культур, давших положительный результат на липолитический скрининг 80
5.2 Липолитическая система p.cryohalolentis 86
5.2.1 Изучение липолитической активности P. cryohalolentis в зависимости от стадии роста культуры и температуры культивирования 87
5.2.2 Моделирование липолитической системы P.cryohalolentis 90
5.3 Холо до активные липолитические ферменты P. Cryohalolentis 95
5.3.1 Получение и характеристика EstPc 95
5.3.2 Получение и характеристика Lip 1Рс 108
5.3.3 Получение и характеристика Ыр2Рс 123
5.3.4. Сравнение свойств липолитических ферментов P. cryohalolentis и гомологичных белков 138
Заключение 146
Выводы 149
Список литературы
