Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Линии ЭСК человека 12
1.1.1 Транскриптомные портреты линий ЭСК 13
1.1.2 Импринтинг в линиях ЭСК 17
1.1.3 Статус X хромосомы в линиях ЭСК 18
1.1.4 Стабильность кариотипа в линиях ЭСК 20
1.2 Культивирование и стабильность кариотипа ЭСК человека 22
1.2.1 Методы хромосомного анализа ЭСК 22
1.2.2 Фидер 24
1.2.2.1 Растворимые факторы фидера 24
1.2.2.2 Нерастворимый матрикс 25
1.2.2.3 Тип фидера 27
1.2.3 Способы пересева 28
1.2.3.1 Появление аномалий кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева 29
1.2.3.2 Сохранение нормального кариотипа ЭСК, культивировавшихся с помощью ферментативного пересева 31
1.2.3.3 Кариотип ЭСК, культивировавшихся с помощью механического пересева 32
1.2.4 Проблема неопределённости факторов культивирования 32
1.3 Хромосомная изменчивость в линиях ЭСК человека 34
1.3.1 Особенности цитогенетического анализа ЭСК 35
1.3.2 Аномалии кариотипа ЭСК 36
1.3.2.1 Численные хромосомные аномалии 37
1.3.2.1.1 Наиболее распространённые численные аномалии хромосом...37
1.3.2.1.2 Редкие численные аномалии хромосом 39
1.3.2.2 Структурные хромосомные аномалии 39
1.4 Возможные последствия хромосомных аномалий 40
1.4.1 Возможные эффекты численных и структурных хромосомных аномалий 40
1.4.2 Эффект положения и трёхмерная структура ядра как фактор регуляции генной экспрессии 44
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1. Материалы 49
2.1.1. Реагенты 49
2.1.2. Антитела, использованные для проведения иммуноокрашивания клеток и криосрезов эмбриоидных телец 49
2.1.3. Ферменты 50
2.1.4. Линии ЭСК 50
2.2. Методы 50
2.2.1. Приготовление фидера 50
2.2.1.1. Культивирование мышиных эмбриональных фибробластов 50
2.2.1.2. Инактивация митотической активности мышиных эмбриональных фибробластов 51
2.2.1.3. Предварительное культивирование фидера перед использованием51
2.2.2. Культивирование ЭСК 51
2.2.2.1. Культивирование ЭСК 51
2.2.2.2. Пересев ЭСК 52
2.2.3. Криоконсервация и размораживание клеток 53
2.2.4. Получение эмбриоидных телец 54
2.2.5. Получение криосрезов и измерение диаметра эмбриоидных телец. 54
2.2.6. Иммуноокрашивание клеток и криосрезов эмбриоидных телец 54
2.2.7. Получение фибробластоподобных производных на основе клеток hESMOl, hESM03, hESM04 55
2.2.7.1. Получение сублинии FhESMO 1.3 55
2.2.7.2. Получение сублиний дифференцированных клеток при спонтанной дифференцировке ЭСК in vitro 56
2.2.8. Получение препаратов метафазных хромосом ЭСК 56
2.2.9. Получение препаратов метафазных хромосом фибробластоподобных клеток 57
2.2.10. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом с помощью DAPI 58
2.2.11. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 58
2.2.12. С-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 58
2.2.13. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH 58
2.2.14. Микродиссекция 59
2.2.14.1. Приготовление игл 59
2.2.14.2. Приготовление микропипеток 59
2.2.14.3. Приготовление покровных стекол 59
2.2.14.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом 59
2.2.14.5. Микродиссекция метафазных хромосом 60
2.2.15. Приготовление ДНК-пробы из ВАС клона RP-11-4В17 60
2.2.16. ПЦР с частично вырожденными праймерами 61
2.2.17. Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек 61
2.2.18. Супрессионная гибридизация in situ 62
2.2.19. Детекция на цитологических препаратах ДНК - проб 63
2.2.20. Микроскопический анализ препаратов после иммуноокрашивания и FISH 63
2.2.21. Получение препаратов для проведения трёхмерной гибридизации. 64
2.2.22. 3D FISH и иммуноокрашивание 64
2.2.23. Лазерная сканирующая микроскопия 64
Глава 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Кариотип клеток hESMOl-04 и характеристика клеток производных сублиний, полученных на их основе 66
3.1.1. Кариотип клеток hESMOl-04 и их фибробластоподобных производных 66
3.1.1.1. Кариотип клеток hESMOl-04 66
3.1.1.2. Хромосомы дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl-04 68
3.1.2. Особенности сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе клеток hESM01-04 69
3.1.2.1. Особенности культивирования сублиний дифференцированных клеток, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04 69
3.1.2.2. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESMOl, hESM03 и hESM04 69
3.1.3. Характеристика ЭСК, несущих аномальные хромосомы 71
3.1.3.1. Выделение сублиний ЭСК, несущих аномальные хромосомы... 71
3.1.3.2. Ростовые свойства клеток hESM01rl8 и hESM03der9 72
3.1.3.3. Анализ наличия маркёров, характерных для плюрипотентных клеток, в клетках hESM01rl8 и hESM03der9 73
3.1.3.4. Особенности получения сублиний дифференцированных клеток на основе hESM01rl8 и hESM03der9 73
3.1.3.5. Анализ наличия тканеспецифических маркёров в эмбриоидных тельцах и дифференцированных клетках сублиний, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9 74
3.1.3.6. Кариотип дифференцированных клеток, полученных на основе hESM01rl8 и hESM03der9 75
Молекулярно-цитогенетическии анализ хромосомных аномалий в клетках hESM01rl8uhESM03der9 76
3.2.1. Анализ аномальной хромосомы в клетках hESM01rl8 76
3.2.2. Анализ аномальных хромосом в клетках hESM03der9 79
Сравнительный анализ положения в интерфазном ядре нормальных хромосом и их аномальных дериватов 87
3.3.1. Разработка методов идентификации хромосомных территорий в интерфазных ядрах ЭСК 87
3.3.2. Сравнительный анализ локализации хромосом 18 и г(18) 91
3.3.3. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9) 94
3.3.3.1. Сравнительный анализ положения хромосом 9 и der(9) 94
3.3.3.2. Сравнительный анализ объёма ядер клеток hESM03der9 и дифференцированных клеток сублиний, полученных на их основе97
Обсуждение 99
3.4.1. Основные направления изучения стабильности кариотипа ЭСК <^9
3.4.2. Фиксация аномальных хромосом в клеточных популяциях ЭСК... ~д Q2
3.4.3. Особенности хромосом недифференцированных клеток и метс=^п><дЬ1 хромосомного анализа "х 04
3.4.4. Хромосомные аномалии, выявленные в клетках bBSMnirig-hESM03der9 i07
3.4.5. Влияние хромосомных аномалий на общую архитектошиш интерфазного ядра
3.4.6. Возможности использования ЭСК, несущих аномальные хромосо в качестве экспериментальных моделей
Выводы
Список литературы
