Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Растительные системы в фармакологии и медицине 12
1.1.1. Преимущества растительных систем 12
1.1.2. Растительные продуценты 14
1.1.2.1. Растения — продуценты рекомбинантных белков 15
1.1.2.2. Растения - продуценты рекомбинантных антител 17
1.1.2.3. Растения - вакцины 21
1.2. Биотехнология растений 26
1.2.1. Методы трансформации растений 26
1.2.1.1. Агробактериальная трансформация 37
1.3. Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений — продуцентов фармакологически значимых белков 54
1.3.1. Отбор трансгенного материала :...54
1.3.2. Наследование перенесенных генов /. :.56
1.3.3. Экспрессия гетерологичных генов 57
1.3.4. Гликозилирование белков в растительных системах 60
1.3.5. Эффективность растительных систем (накопление целевого продукта)64
1.4. Иммуностимуляторы для животноводства 69
1.4.1. Интерферон и его функции 71
1.4.1.1. Классификация интерферонов 72
1.4.1.2. Участие у-интерферона в системе иммунного ответа 73
1.4.2. Создание и применение препаратов у-интерферона в медицине и
ветеринарии 76
ГЛАВА II. Материалы и методы 80
1. Растительный материал 80
1.1. Стерилизация семян 85
1.2. Условия культивирования растительного материала 85
1.3. Селекция трансгенных растений табака и гороха 85
1.2. Штамм Agrobacterium tumefaciens 86
2.1. Условия культивирования агробактериального штамма 87
3. Методы агробактериальной трансформации 88
II.3.1. Метод трансформации листовых дисков табака in vitro 88
П.3.2. Метод трансформации незрелых зародышей гороха in vitro 89
II.3.3. Метод трансформации цветков гороха in vivo 91
П.3.4. Метод трансформации проростков гороха inplanta 91
11.4. Молекулярные методы 92
II.4.1. Выделение геномной растительной ДНК 92
И.4.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacteriam twnefaciens 93
П.4.3. Выделение тотальной растительной РНК 94
П.4.4. Постановка реакции обратной транскрипции 94
11.4.5. ПНР-анализ 95
11.4.6. Разделение продуктов ПЦР-реакций методом электрофореза 97
П.4.7. Экстракция цитоплазматических белков из растительного материала.97
И.4.8. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 98
II.4.9. Диализ белковых проб 98
П.4.10. Разделение белков методом электрофореза в ПААГ 99
11.4.11. Окрашивание гелевых пластин 100
11.4.12. Вестерн-блот анализ 100
11.4.13. Дот-блот анализ 102
11.5. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей 103
П.5.1. Серологический анализ крови 103
И.5.2. Иммуноферментный анализ 104
11.6. Статистические методы и компьютерная обработка 105
П.6.1. Статистические методы 105
П.6.2. Построение денситограмм 105
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 106
Ш.1. Получение линий трансгенных растений табака — продуцентов у-интерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена 106
III. 1.1. Анализ наследования гена у-интерферона у трансгенных растений табака (ТГТ3) 107
III. 1.2. Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (То-Т3) 111
III. 1.2.1. Анализ стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (Ti-T3) Ill
III. 1.2.2. Изучение экспрессии гетерологичного гена у-интерферона у потомков исходных трансформантов InterB и Inter311 (ТГТ2) методом ІТЦР- анализа в реальном времени 120
III. 1.3. Анализ белковых проб трансгенных растений табака семей Inter311 и InterB 123
III. 1.4. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей 127
III. 1.4.1. Приготовление белкового экстракта, содержащего у-интерферон из трансгенных растений табака линии Inter.311.2 127
III. 1.4.2. Анализ активности у-интерферона, выделенного из трансгенных растений линии Inter311.2 на лабораторных мышах 129
Ш.2. Создание «съедобных» иммуномодуляторов на основе растений гороха 138
III.2.1. Трансформация культуры гороха in vitro 139
Ш.2.1.1. Изучение регенерационной способности растений гороха в условиях in vitro 139
Ш.2.1.2. Изучение корнеобразования у растений гороха в условиях in vitro 140
Ш.2.1.3. Изучение влияния селективного агента Km на процесс трансформации и определение сублетальной концентрации Km для
культуры гороха 142
Ш.2.2. Трансформация гороха in vivo 148
III.2.2.1. Трансформация цветка 148
Ш.2.2.2. Трансформация проростков гороха inplanta 149
Заключение 152
Выводы 155
Список литературы
