Оглавление
Список сокращений ...................................................................................... 4
1 Введение................................................................................................... 6
1.1 Актуальность темы работы.............................................................................................6
1.2 Цель работы.....................................................................................................................7
1.3 Научная новизна..............................................................................................................8
1.4 Теоретическая и практическая значимость работы.....................................................9
1.5 Основные положения, выносимые на защиту:.............................................................9
1.6 Личный вклад.................................................................................................................10
1.7 Объем и структура диссертации ..................................................................................11
1.8 Полнота опубликования в печати и апробация результатов ....................................11
1.8.1 Статьи в рецензируемых журналах: .......................................................................11
1.8.2 Тезисы докладов ......................................................................................................13
2 Литературный обзор.............................................................................. 17
2.1 Нуклеоид–ассоциированные белки бактерий............................................................17
2.2 Гистоноподобный белок HU.........................................................................................22
2.2.1 Общая характеристика HU белка. ...........................................................................23
2.2.2 Пространственная структура HU белка...................................................................24
2.2.3 Взаимодействие HU белка E. coli с нуклеиновыми кислотами. ...........................26
2.2.4 Механизмы взаимодействие гистоноподобных белков с ДНК............................27
2.2.5 Внеклеточные функции HU белка и его связь с патогенезом бактерий..............38
2.2.6 HU белок – потенциальная фармакологическая мишень.....................................42
3 Материалы и методы............................................................................. 45
3.1 Материалы. ....................................................................................................................45
3.2 Методы...........................................................................................................................50
3.2.1 Клонирование генов HU белков и получение плазмидных конструкций...........50
3.2.2 Приготовление и трансформация химически–компетентных клеток E.coli и
трансформация плазмидной ДНК....................................................................................................50
3.2.3 Наработка рекомбинантных белков.......................................................................51
3.2.4 Выделение и очистка рекомбинантных HU белков. .............................................51
3.2.5 Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле. ................52
3.2.6 Метод анализа изменения электрофоретической подвижности ДНК. ...............53
3.2.7 Расчет констант диссоциации ДНК–белковых комплексов..................................533
3.2.8 Определение концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) ...........54
3.2.9 Дифференциальная сканирующая калориметрия. ...............................................54
3.2.10 Сайт–направленный мутагенез...............................................................................55
3.2.11 Изотермическая титрационная калориметрия......................................................55
4 Результаты и обсуждения..................................................................... 56
4.1 Биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей
гистоноподобных белков бактерий.....................................................................................................56
4.2 Получение рекомбинантных HU белков HUEcoli, HUNg, HUMgal, HUSpm и изучение
их ДНК–связывающих способностей...................................................................................................58
4.2.1 Получение белковых препаратов. ..........................................................................58
4.2.2 Сравнительный анализ особенностей ДНК–связывания исследуемых
гистоноподобных белков..................................................................................................................60
4.3 Пространственная структура HUSpm, полученная методом рентгеноструктурного
анализа. 67
4.3.1 Особенности границы между мономерами в димере HUSpm. ...........................69
4.3.2 Структурные детерминанты термостабильности HUSpm.....................................75
4.4 Бисфенольные производные флуорена ингибируют ДНК–связывающую
способность HU белков и рост микоплазмы в культуре....................................................................78
4.4.1 Поиск низкомолекулярных ингибиторов HU белков. ...........................................78
4.4.2 Влияние БФП на ДНК–связывающие свойства HU белков и рост микоплазмы в
культуре. 82
4.4.3 Уточнение сайта связывания БПФ методом сайт–специфического мутагенеза.85
Заключение и выводы................................................................................. 92
Список литературы..................................................................................... 93
