Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Критерии злокачественной трансформации и возникновения опухоли 13
1.2. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (TSG) 17
1.3. Нестабильность генома и повреждения «онкозначимых» генов в опухолях 23
1.4. Роль метилирования ДНК при онкогенезе 25
1.4.1. CpG-островки в геноме человека 25
1.4.2. Гипометилирование генома опухолей 28
1.4.3.Гиперметилирование CpG-островков TSG в опухолях 30
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов 33
1.5. Основные подходы при поиске «онкозначимых» генов 36
1.5.1. Анализ аллельных делений и умножения копий гена в опухолях 38
1.5.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли 40
1.5.3. «Вычитающая» гибридизация как способ отбора онкогенов и
TSG 41
1.5.4. Применение микропанелей для скрининга генов, изменяющих копийность, метилирование или экспрессию в опухолях 45
1.5.5. Анализ метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG и онкогенов 47
2. Материалы и методы 52
2.1. Клонотека рекомбинантных космид хромосомы 13 52
2.2. Клоны хромосомы 3 52
2.3. Выделение ДНК 53
2.4. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования 55
2.5. Получение компетентных клеток E.coli JM109 и DH5a и трансформация плазмидной ДНК 56
2.6. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК 57
2.7. Окрашивание фрагментов ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ) азотнокислым серебром. 59
2.8. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклео-тидкиназы фага Т4 и гибридизация по Саузерну 59
2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 60
2.10. Определение нуклеотидной последовательности
клонированных фрагментов ДНК 61
2.11. Статистическая обработка данных скрининга панелей 62
2.12. Определение частоты встречаемости аллей и генотипов 63
2.13. Образцы первичных опухолей 63
2.14. Клеточные линии опухолей и их культивирование 65
2.15. Анализ аллельных дисбалансов (AI) полиморфных маркеров хромосомы Зр в ДНК опухолей 66
2.16. Мультиплексная ПЦР для анализа копийности фрагментов ДНК и
картирования гомозиготных делений (HD) 68
2.17. Анализ метилирования ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз 69
2.18. Бисульфитная конверсия ДНК 72
2.19. Метилспецифичиая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) 73
2.20. Бисульфитное секвенирование 75
2.21. Компьютерный анализ баз данных проекта SAGE (серийного
анализа экспрессии генов ) 76
2.22. Выделение РНК 77
2.23. Синтез кДНК 78
2.24. Полуколичественная ОТ-ПЦР 78
2.25. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) 79
2.26. Статистические методы при анализе частот AI полиморфных 82 маркеров, частот изменения уровня мРНК генов и метилирования промоторных областей
2.27. Основные компьютерные программы, использованные в работе 83
3. Результаты и их обсуждение 84
3.1. Идентификация микросателлитных маркеров на хромосомах 3
и 13 84
3.1.1. Микросателлиты на хромосоме 13 85
3.1.1.1. Частоты встречаемости и особенности распределения дитри- и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы 13 85
3.1.1.2. Субклонирование и определение нуклеотидной последова тельности микросателлитов на 13q; гетерогенность повторов 89
3.1.1.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 13 93
3.1.2. Микросателлиты на хромосоме 3 96
3.1.2.1. Частоты встречаемости и особенности распределения микросателлитов в Notl-связующих и прыжковых клонах хромосомы 3 и в космидах из области LUCA (Зр21.31) 97
3.1.2.2. Микросателлиты в Notl-связующих и прыжковых клонах как маркеры генов; структура повторов в некоторых микросателлитах 101
3.1.2.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 106
3.2. Картирование «критичных» районов Зр в эпителиальных
опухолях пяти видов 109
3.2.1. Картины аллелыюго дисбаланса полиморфных маркеров Зр в эпителиальных опухолях 109
3.2.2. Частота аллельных изменений в разных районах Зр в опухолях пяти видов; типы аллельных делений 111
3.2.3. «Критичные» районы Зр, общие для опухолей разного происхождения; идентификация новой «горячей точки» МЕСАЗ в районе Зр21.31 122
3.2.4. Повышенная частота амплификации аллелей в районе МЕСАЗ (D3S2409-D3S3667) 124
3.2.5. Сужение критичных районов АР20 и LUCA (Зр21.33, Зр21.31) 126
3.2.6. Корреляция частоты аллельных изменений в критичных районах Зр с прогрессией опухолей
3.3. Идентификация потенциальных TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ и других критичных районах Зр
3.3.1. Скрининг кандидатов на роль TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ с помощью программы серийного анализа экспрессии генов (SAGE)
3.3.2. Изменения уровня мРНК генов DAG1, RHOAIARHA, GPX1
(МЕСАЗ) и TSG SEMA3B в клеточных линиях и первичных опухолях
3.3.3. Гомозиготные делеции в области гена GPX1 и умножение копий гена RHOAIARHA в опухолях
3.3.4. Изменение содержания альтернативных транскриптов гена USP4 в опухолях
3.3.5. Новый вариант сплайсинга и изменение копийности гена MST1R/RON в опухолях
3.3.6. Кандидаты на роль TSG из других ключевых районов Зр: изменение уровня мРНК в опухолях и структурные изменения в генах
3.4. Метилирование промоторных областей генов RASSF1A, SEMA3B, RHOA и MST1R/RON в эпителиальных опухолях разной локализации
3.4.1. TSG RASSF1A (LUCA, Зр21.31)
3.4.2. Кандидат на роль TSG, ген SEMA3B (ШСА, Зр21.31)
3.4.3. Протоонкоген RHOAIARHA (МЕСАЗ, Зр21.31)
3.4.4. Кандидат на роль протоонкогена MST1RIRON (МЕСАЗ, Зр21.31)
3.4.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров Заключение. Перспективы дальнейших исследований
Выводы
