Введение
2. Обзор литературы
2.1. Транскрипционные факторы, содержащие домен цинковых пальцев 9
2.2. CTCF - представитель многофункциональных белков, содержащих мотивы цинковых пальцев 14
2.3 Структурные особенности 14
2.4 Полифункциональность белка CTCF и регуляция его активности 20
2.5 Функции транскрипционного фактора CTCF
2.5.1 Регуляция транскрипции 22
2.5.2 Взаимодействие CTCF с последовательностями инсуляторов 26
2.5.3 Контроль импринтинга генетической информации 32
2.6 Boris 36
2.7 CTCF и развитие болезней 37 2.8 Методы исследования ДНК-белковых взаимодействий 39
2.9 Сдвиг электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле 40
2.10 Метод иммунопреципитации хроматина 41
2.11 ДНК-белковые кросс-сшивки (DNA-protein crosslinking assay, DPC) 45
Заключение 46
3. Материалы и методы
3.1 Материалы 48
3.2 Методы 52
3.2.1 Получение белка CTCF в бесклеточной системе 53
3.2.2 Электрофорез белков в SDS-полиакриламидном геле 53
3.2.3 Вестерн блот анализ 53
3.2.4 Получение библиотеки фрагментов ДНК локуса FXYD5-COX7A 19 хромосомы человека 54
3.2.5 Радиоактивное мечение фрагментов ДНК при помощи ПЦР 55
3.2.6 Очистка меченой ДНК 55
3.2.7 Связывание меченых фрагментов ДНК с белками (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 56
3.2.8 Сдвиг электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле 56
3.2.9 Связывание библиотеки коротких фрагментов ДНК с транскрипционным фактором CTCF. Разделение фрагментов в первом направлении 57
3.2.10 Разделение фрагментов во втором направлении 57
3.2.11 Клонирование библиотеки и трансформация клеток Е. coli 58
3.2.12 Приготовление компетентных клеток Е.coli и их трансформация 58 3.2. 13 Ранжирование и анализ библиотеки 58
3.2.14 Выделение плазмид из клонов, содержащих фрагменты, связывающиеся с CTCF 59
3.2.15 Культивирование клеток 59
3.2.16 Иммунопреципитация хроматина 59
3.2.17 ПЦР-амплификация 61
3.2.18 Секвенирование и картирование последовательностей 63
4. Результаты и обсуждение 64
4.1 Получение белка CTCF и его функциональный анализ 64
4.2 Отбор фрагментов, связывающихся с CTCF 67
4.3 Клонирование фрагментов в вектор и трансформация клеток Е. coli 69
4.4 Ранжирование полученных клонов и проверка на наличие вставки 69
4.5 Анализ отобранных фрагментов методом EMSA 70
4.6 Картирование участков связывания CTCF в локусе FXYD5-COX7A1 71
4.7 Проверка способности обнаруженных фрагментов ДНК связываться с белком CTCF методом иммунопреципитации хроматина (ChlP-Chromatin Immunoprecipitation) 71
4.8 Картирование и анализ расположения фрагментов, связывающихся с CTCF, в локусе FXYD5-COX7A1 19 хромосомы человека 73
4.9 Функциональный анализ последовательностей, обладающих инсуляторной активностью.75
Выводы 85
