Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Проблема загрязнения почвогрунтов ФОС 10
1.1.1 Оценка экологической ситуации, связанной с накоплением ФОС в почвогрунтах
1.1.2 Запрещенные и непригодные к использованию запасы пестицидов 12
1.2 Методы очистки почв от загрязнений 14
1.2.1 Детоксификация почвогрунтов с использованием ферментов 18
1.2.1.1 Иммобилизация ферментов для детоксификации почвогрунтов 21
1.2.1.2 Фермент органофосфатгидролаза и его физико-химические характеристики
1.2.1.3 Гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза 27
1.2.2 Детоксификация почвогрунтов с помощью клеток микроорганизмов 28
1.2.2.1 Методы стабилизации и повышения эффективности действия клеток микроорганизмов в почвогрунте. Кворум-зависимые бактериальные системы
1.2.2.1.1 Кворум-зависимые системы у грамотрицательных клеток бактерий
1.2.2.1.2 Ферментативное разрушение автоиндукторов «кворумного ответа» у грамотрицательных клеток бактерий
1.2.2.2 Методы стабилизации клеток микроорганизмов в почвогрунте. 39
Иммобилизация клеток микроорганизмов
1.2.2.3 ФОС-деградирующий потенциал клеток бактерий 40
Pseudomonas sp. 78Г
2 Экспериментальная часть 43
2.1 Материалы и приборы 43
2.1.1 Реактивы 43
2.1.2 Бактериальные штаммы 44
2.1.3 Питательные среды 44
2.1.5 Приборы 45
2.2 Методы 45
2.2.1 Экспрессия и выделение His6-OPH 45
2.2.2 Подготовка крио-ПААГ носителей для выделения Hise-OPH 47
2.2.3 Определение концентрации белка
2.2.4 Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле 47
2.2.5 Обработка данных электрофореза 48
2.2.6 Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой His6-OPH
2.2.7 Иммобилизация фермента His6-OPH 49
2.2.8 Определение активности иммобилизованного фермента His6-OPH 49
2.2.9. Исследование термостабильности, температурного и рН-оптимума 50 иммобилизованного ферментного биокатализатора, полученного на основе His6-OPH
2.2.10 Щелочная делигнификация целлюлозосодержащих носителей 50
2.2.11 Разложение ФОС в почвогрунтах под действием иммобилизованной His6-OPH
2.2.12 Хроматографический анализ ФОС 51
2.2.13 Определение концентрации фосфат-ионов в почвогрунте 52
2.2.14 Иммобилизация клеток микроорганизмов в криогель поливинилового спирта
2.2.15 Определение концентрации внутриклеточного АТФ в свободных и иммобилизованных клетках биолюминесцентным методом
2.2.16 Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
2.2.17 Определение концентрации глицерина в реакционной среде
2.2.18 Иммобилизованные и свободные клетки бактерий в процессе деградации ФОП и продуктов их разложения
2.2.19 Определение кинетических параметров роста свободных клеток бактерий
2.2.20 Контроль интенсивности аэрации среды 55
2.2.21 Окрашивание клеток микроорганизмов по Граму 57
2.2.22 Функционирование разработанного бактериального консорциума в системе параоксон-гексадекан
2.2.23 Детоксификация песчаного почвогрунта под действием консорциума, составленного на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
2.2.24 Хроматографический анализ гексадекана 58
2.2.25 Определение влажности экспериментальных образцов 59
2.2.26 Кинетические исследования реакции гидролиза N-ацилгомосеринлактонов под действием фермента Hise-OPH и клеток микроорганизмов
2.2.27 Выравнивания аминокислотных последовательностей белков 61
2.2.28 Получение супернатанта из клеток R. ruber АС-1513D 62
2.2.29 Определение интенсивности биолюминесценции у клеток 62
P. phosphoreum
2.2.30 Определение N-ацилгомосеринлактонов в средах, полученных после культивирования клеток бактерий рода Pseudomonas
3 Результаты и обсуждение 64
3.1 Иммобилизованный биокатализатор на основе фермента His6-OPH для гидролиза ФОС в почвогрунте
3.1.1 Разработка биокатализатора в виде иммобилизованного фермента и исследование его характеристик
3.1.2 Применение иммобилизованного биокатализатора на основе Hise-OPH 74 и делигнифицированной соломы для детоксификации почвогрунтов
3.2. Иммобилизованные клетки E.coli SG13009[pREP4] как инокулят для получения клеток с His6-OPH-aKTHBHOCTbK
3.3 Микроорганизмы и консорциумы на основе микроорганизмов для детоксификации ФОС в почвогрунтах и водных системах
3.3.1 Разложение ФОС под действием свободных и иммобилизованных 85
клеток бактерий
3.3.1.1 Иммобилизованные и свободные клетки Pseudomonas sp. 78Г и 87 Pseudomonas esterophilus в процессе деградации параоксона и п-нитрофенола
3.3.1.2 Иммобилизованные и свободные клетки Rhodococcus erythropolis 94 AC-1514D и Rhodococcus ruber AC-1513D в процессе деградации ФОС
3.3.2 Консорциум на основе клеток бактерий, осуществляющих деградацию ФОС
3.3.2.1 Оптимизация состава иммобилизованного микробного консорциума
3.3.2.2 Оптимизация получения иммобилизованного консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.3.2.3 Исследование постоянства состава консорциума, полученного на основе клеток P. esterophilus HR. ruber AC-1513D
3.3.2.4 Деградация различных ФОП под действием иммобилизованного ПО консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.3.2.5 Функционирование консорциума на основе клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D в системе параоксон-гексадекан
3.3.2.6 Детоксификация песчаного почвогрунта под действием консорциума на основе клеток бактерий P. esterophilus и R. ruber АС 1513D
3.4 N-ацилгомосеринлактоназы из клеток бактерий рода Rhodococcus
3.4.1 Сравнение аминокислотной последовательности ОРН и 116
аминокислотных последовательностей, присутствующих в клетках рода Rhodococcus
3.4.2 Лактоназная активность клеток R. erythropolis AC-1514D и R. ruber AC-1513D
3.4.3 Анализ супернатанта, полученного после дезинтеграции клеток R. ruber AC-1513D
ЗАЛ Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназы в клетках бактерий R. ruber AC-1513D под действием N-ацилгомосеринлактонов
3.4.5 Биосинтез N-ацилгомосеринлактоназ в клетках бактерий рода Rhodococcus в присутствии клеток рода Pseudomonas
3.4.5.1 Определение наличия N-ацилгомосеринлактонов в средах, полученных после культивирования клеток Pseudomonas sp. 78Г и
P. esterophilus
3.4.5.2 Индукция биосинтеза N-ацилгомосеринлактоназ в клетках Rhodococcus с использованием сред, полученных после культивирования
клеток P. esterophilus и Pseudomonas sp. 78Г
3.5 Принцип функционирования консорциума, состоящего из клеток P. esterophilus и R. ruber AC-1513D
3.6 Взаимосвязь ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ 132
3.6.1 Сравнительный анализ ОРН и N-ацилгомосеринлактоназ 132
3.6.2 Лактоназная активность фермента His6-OPH 136
3.6.3 Гипотеза эволюционного родства N-ацилгомосеринлактоназ из клеток рода Rhodococcus и ОРН
Выводы 151
Список литературы
