Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Открытие мембранного рецептора цитокининов 10
1.1.1 Бикомпонентная регуляторная система 11
1.1.2. Обнаружение и характеристика генов Л rabidopsis, кодирующих сенсорные гистидиновые киназы, участвующие в передаче цитокининового сигнала 14
1.1.3. Другие белки бикомпонентной регуляторной системы, задействованные в передаче цитокининового сигнала 18
1.1.3.1. Характеристика белков - регуляторов ответа А-типа 20
1.1.3.2. Характеристика белков - регуляторов ответа В-типа 21
1.1.3.3. Обнаружение и характеристика фосфотрансмиттерных белков 24
1.1.4. Обобщение данных о передаче цитокининового сигнала через мембранный рецептор 25
1.2. Цитоплазматические и ядерные цитокинин-связывающие белки 27
1.3. Обнаружение и характеристика цитокинин-связывающих белков в хлоропластах 29
1.4. Множественность путей реализации цитокининовых сигналов в клетках растений 31
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований 34
2.1. Растительный материал 34
2.2. Моноклональные антитела против ЦСБ-70 34
2.3. Вьщеление моноклональных антител из асцитной жидкости мышей
2.4. Выделение моноклональных антител из культуральной среды 35
2.5. Биотинилирование МА 36
2.6. Фракционирование белкового экстракта из проростков кукурузы 36
2.7. Определение цитокинин-связывающей активности белков 37
2.8. Сэндвич-вариант твердофазного ИФА 37
2.9. Получение белковых экстрактов из различных частей проростка 38
2.10. Определение числа клеток 38
2.11. Определение содержания белка 38
2.12. Определение содержания эндогенных цитокининов 39
2.13. Выделение полирибосом 39
2.14. Синтез аффинного сорбента на основе МА и Sepharose CL-4B (Pharmacia) 40
2.15. Синтез аффинного сорбента на основе зеатинрибозида и Toyopearl HW-65 41
2.16. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованными МА 41
2.17. Клонирование кДНК (1-й вариант) 42
2.18. Аффинная хроматография полисом на колонке с иммобилизованным зеатинрибозидом 43
2.19. Клонирование кДНК (2-й вариант) 43
2.20. Анализ библиотек кДНК методом иммуноскрининга на чашках 44
2.21. Анализ клеточных белков Е. coli методом иммуноблотинга 44
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Моноклональные антитела к ЦСБ-70, их выделение и характеристика 46
3.2. Разработка тест-системы для анализа ЦСБ-70 на основе сендвич-варианта ИФА в сочетании с стрептавидин-биотиновой системой 50
3.3. Локализация ЦСБ-70 в меристеме и зоне растяжения корня 55
3.4. Локализация ЦСБ-70 в этиолированном проростке кукурузы 58
3.5. Динамика содержания ЦСБ-70 в различных органах проростка в процессе его роста 64
3.6. Использование моноклональных антител для выделения мРНК, конструирования и анализа библиотеки кДНК из проростков кукурузы... 67
Заключение 81
Выводы 84
Литература 86
