Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Listeria monocytogenes: место в инфекционной патологии человека 12
1.2. Этапы развития инфекционного процесса 13
1.3 Основные механизмы внутриклеточного размножения 14
1.4. Структурно-функциональная характеристика факторов инвазии семейства интерналинов 18
1.6. Рецептор фактора роста гепатоцитов: Механизмы и клеточные функции 28
1.6.1 MAPK-каскад, PI3K/Akt-путь и STAT-путь 28
1.7. Ответ макроорганизма на внедрение микроорганизма 33
1.8. Использование бактериальных продуктов в терапевтических целях 36
Глава 2. Материалы и методы 40
2.1 Бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры 40
2.2 Микробиологические методы 46
2.2.1 Условия культивирования 46
2.2.2 Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток 46
2.2.3 Приготовление компетентных клеток 46
2.2.4 Электропорация 47
2.3 Молекулярно-генетические методы 47
2.3.1 Полимеразная цепная реакция 47
2.3.2 Электрофорез в агарозном геле 48
2.3.3 Лигирование 49
2.3.4 Рестрикция 49
2.3.5 Выделение плазмидной ДНК 49
2.3.6 Определение нуклеотидной последовательности 49
2.4. Методы экспрессии и очистки белка 50
2.5. Методы, анализа очищенных белковых препаратов 50
2.5.1 Электрофорез белков в полиакриламидном геле 50
2.6. Биологические методы 51
2.6.1 Клеточные линии и условия их культивирования 51
2.6.2 Оценка метаболической активности клеток в МТТ-тесте 52
2.6.3 Оценка митотического индекса эукариотических клеток с использованием флуоресцентной микроскопии 53
2.6.4 Оценка перестройки цитоскелета с использованием флуоресцентной микроскопии 53
2.6.5 Оценка подвижности эукариотических клеток с использованием метода царапины 54
2.6.6 Оценка активации сигнальных путей с использованием флуоресцентной микроскопии 54
2.6.7 Оценка активации сигнальных путей с использованием коммерческого ИФА-анализа 55
2.6.8 Оценка скорости заживления скарифицированных ран с использованием мышиной модели 55
2.6.9 Определение эффективности инвазии в эукариотические клетки 55
2.6.10 Определение уровня интерферона- после инкубации культуры первичных макрофагов и эпителиальных клеток с различными природными вариантами интерналинового домена 56
2.7 Статистические методы 57
Глава 3. Результаты собственных исследований 58
3.1 Конструирование рекомбинантных штаммов E. coli для экспрессии природных вариантов idInlB 58
3.2 Экспрессия и очистка вариантов idInlB 61
3.3 Влияние вариантов idInlB на пролиферацию перевиваемых и первичных клеточных линий 63
3.4 Влияние вариантов idInlB на перестройки актинового цитоскелета перевиваемой и первичной клеточных линий 70
3.5 Оценка мотогенного эффекта природных вариантов интерналина В 75
3.6 Анализ активации внутриклеточных сигналов 76
3.7 Рекомбинантный idInlB ускоряет заживление скарифицированных ран 92
Глава 4. Обсуждение 96
Выводы 109
Список литературы 110
