Введение
1. Обзор литературы
1.1. Обзор методов искусственной эволюции in vitro 10
1.1.1. Классификация методов 14
1.1.2. Методы, основанные на мутагенезе 17
1.1.3. Методы, основанные на рекомбинации 21
1.1.4. Методы скрининга и селекции 47
1.1.5. Применение ДНК шаффлинга 48
1.1.6. Искусственная эволюция in silico (компьютерное моделирование) 49
1.1.7. Дальнейшие перспективы развития методов искусственной эволюции 51
1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции
1.2.1. Микроорганизмы - продуценты ЦГТаз 53
1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз 56
1.2.3. Свойства и применение циклодекстринов 59
1.2.4. Поиск и получение новых ЦГТазных штаммов 61
2. Объекты и методы исследования
2.1. Объекты исследований 63
2.2. Микробиологические методы
2.2.1. Питательные среды 63
2.2.2. Селективные среды и буферы 64
2.2.3. Условия культивирования и инокуляции 70
2.2.4. Отбор почвенных образцов, получение чистых линий, микроскопия 71
2.3. Биохимические методы
2.3.1. Определение оптической плотности биомассы 71
2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности 71
2.4. Молекулярно-биологические методы исследований
2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК 72
2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 73
2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в полиакриламидном геле 74
2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля 74
2.4.5. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой 74
2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами 75
2.4.7. Выделение векторной ДНК «медленным» способом 75
2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК 76
2.4.9. Подготовка компетентных клеток 76
2.4.10. Трансформация компетентных клеток Е.coli плазмидной ДНК 77
2.4.11. Получение одноцепочечной ДНК 78
2.4.12. Фрагментирование ДНК при помощи ДНКазы I и ультразвука 79
2.4.13. ДНК шаффлинг 79
2.4.14. Выделение и очистка тотальной ДНК 81
2.4.15. Геномный шаффлинг 82
2.4.16. ДНК/геномный шаффлинг 83
2.4.17. Анализ тотальных ДНК при помощи метода RAPD 84
2.5. Реактивы и материалы 85
2.6. Составы использованных стандартных растворов 87
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Проведение асимметричного ДНК шаффлинга (с одно и двуцепочечными ДНК) 88
3.2. Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга 97
3.3 Проведение геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069 98
3.4. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1 100
3.5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 9 и ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 1005 102
3.6. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2 107
3.7. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 839 и алкалофильным денитрификатором Bacillus nitritophilus IB-256 110
Заключение 121
Выводы 126
