Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Стратегия генной терапии и необходимость адекватных методов контроля 9
1.2. Краткий обзор современных методов молекулярной визуализации in vivo 11
1.3. Радионуклидные репортерные системы 13
1.3.1. Ферментативные репортерные системы 14
1.3.2. Рецепторные радионуклидные системы 15
1.3.3. Транспортерные репортерные системы 16
1.4. Натрий-йодидный симпортер 17
1.4.1. Синтез тиреоидных гормонов в организме 17
1.4.2. Радиойоддиагностика и радиойодтерапия 19
1.4.3. Клонирование гена NIS из разных организмов 20
1.4.4. Функциональная экспрессия NIS в организме 21
1.4.5. Структура и транспортная активность NIS 23
1.4.6. Использование NIS в качестве репортерного гена 25
1.4.7. Использование NIS в качестве терапевтического гена 28
1.4.8. Использование специфичных промоторов совместно с NIS 32
2. Материалы и методы 34
2.1. Материалы 34
2.1.1. Культуры эукариотических клеток 34
2.1.2. Бактериальные клетки 34
2.1.3. Животные 34
2.1.4. Реактивы 34
2.1.5. Ферменты 35
2.1.6. Антитела 35
2.1.7. Буферные растворы 35
2.1.8. Микробиологические среды 36
2.1.9. Наборы реактивов 36
2.1.10. Маркеры 36
2.1.11. Олигонуклеотиды 36
2.1.12. Плазмидные векторы 38
2.1.13. Полиплексы 38
2.2. Методы 38
2.2.1. Стандартные процедуры 38
2.2.2. Секвенирование ДНК 39
2.2.3. Выделение РНК гуанидин изотиоционатным методом 39
2.2.4. Синтез одноцепочечной кДНК с помощью обратной транскрипции 39
2.2.5. Полуколичественная оценка экспрессии генов методом ОТ-ПЦР 40
2.2.6. Транзиентная трансфекция клеток в условиях in vitro 41
2.2.7. Вестерн-блот анализ клеточных лизатов 41
2.2.8. Определение промоторной активности методом двойной люциферазной детекции 42
2.2.9. Измерение поглощения 125I- клетками в условиях in vitro (RIUA) 2.2.10. Измерение пероксидазной активности в экстрактах клеток и кондиционированных средах 44
2.2.11. Получение стабильно трансфицированных клеток с помощью лентивирусного вектора pLVX-Puro 45
2.2.12. Выявление распределения изотопа 123I и его накопления в опухолях с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии 46
3. Результаты и обсуждение 47
3.1. Создание экспрессионных векторов, несущих ген rNIS в качестве репортерного гена
3.1.1. Поиск биологического источника для получения кДНК гена NIS, анализ содержания транскриптов гена NIS в разных тканях 47
3.1.2. Клонирование кДНК гена rNIS 49
3.1.3. Получение экспрессионных генетических конструкций, несущих ген rNIS под контролем различных регуляторных элементов 51
3.1.4. Оценка длины продукта экспрессии клонированного rNIS в клетках млекопитающих 54
3.2. Исследование активности NIS, образующегося при доставке различных экспрессионных конструкций в клетки меланомного происхождения in vitro 56
3.2.1. Функциональный анализ экспрессионных конструкций с геном rNIS в клетках меланомного происхождения 56
3.2.2. Использование меланомо- и опухолеспецифичных промоторов в репортерной системе на основе rNIS 3.3. Изучение диффузии радиойодида из клеток, экспрессирующих NIS, в условиях in vitro 66
3.4. Изучение кинетических параметров репортерной системы на основе NIS в клетках, экспрессирующих лактопероксидазу
3.4.1. Клонирование кДНК гена лактопероксидазы мыши (LPO) 70
3.4.2. Получение экспрессионных генетических конструкций, несущих гены LPO-E и LPO-M 72
3.4.3. Функциональный анализ экспрессионных конструкций с генами LPO-E и LPO-M в клетках млекопитающих 75
3.4.4. Изучение диффузии 125I из клеток, экспрессирующих NIS и LPO-E, в условиях in vitro 3.5. Создание линии клеток меланомного происхождения, стабильно продуцирующей натрий-йодидный симпортер 81
3.6. Визуализация NIS-позитивных клеток меланомы in vivo c помощью ОФЭКТ/КТ...84
3.7. Оценка эффективности системной доставки гена rNIS в опухоли меланомы путем визуализации NIS-позитивных клеток c помощью ОФЭКТ/КТ 86
Заключение и выводы 91
Заключение 91
Выводы 92
Cписок сокращений 93
Список литературы 94
