Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Ишемический инсульт 9
1.1.1. Этиология и патогенез заболевания 9
1.1.2. Ядро инфаркта и зона пенумбры 10
1.2 Каскады ишемического повреждения 11
1.2.1. Нарушение энергетического метаболизма 11
1.2.2. Эксайтотоксичность 12
1.2.3. Оксидантный (окислительный) стресс 12
1.2.4. Усиление проницаемости гематоэнцефалического барьера в условиях ишемии
1.3 Генная экспрессия в условиях ишемии 15
1.4 Иммунный ответ и процессы постишемического воспаления
1.4.1. Воспаление: классическое представление 18
1.4.2. Микроглия и ее роль в постишемическом воспалении 19
1.4.3. Медиаторы воспаления 21
1.4.4. Цитокины и их функции в ЦНС 22
1.4.5. Хемокины и их функции в условиях ишемии 23
1.4.6. Каскад системы комплемента – важный путь иммунного ответа 24
1.4.7. Рекрутинг лейкоцитов в условиях ишемического повреждения тканей головного мозга 27
1.4.8. Лимфоциты в ЦНС в условиях ишемического повреждения 29
1.4.9. Дендритные клетки и их роль в постишемических событиях
1.5 Постишемическая иммунодепрессия 35
1.6 Пептидный нейропротекторный препарат семакс
1.6.1. Синтетический гептапептид семакс 37
1.6.2. АКТГ как прототип нейропептида семакс 39
1.6.3. Ноотропные и нейропротективные свойства семакса 40
1.6.4. Индукция генной транскрипции при ишемии: сложности интерпретации 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1.Этапы организации эксперимента 43
2.1.1. Объект исследования 43
2.1.2. Моделирование фокальной церебральной ишемии 43
2.1.3. Формирование экспериментальных групп животных 43
2.2. Получение образцов для исследования 44
2.2.1. Используемые реактивы: растворы, буферы 44
2.2.2. Выделение суммарной РНК 45
2.2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации РНК в суспензии 46
2.2.4. Проверка качества РНК с помощью электрофоретического разделения суммарной РНК в агарозном геле 46
2.2.5. Синтез одноцепочечной кДНК 47
2.3 Анализ экспрессии генов семейства ангиогенных факторов роста VEGF 48
2.3.1. Праймеры для реакции ПЦР в реальном времени 48
2.3.2. Реагенты для метода ПЦР в реальном времени. 48
2.3.3. Выполнение ПЦР в реальном времени 49
2.3.4. Статистический анализ данных 51
2.4 Анализ экспрессии генов семейства факторов роста с помощью панелей «RTІ
Profiler PCR Arrays» 52
2.4.1. Описание панелей генов факторов роста 52
2.4.2. Реагенты для метода ПЦР в реальном времени 53
2.4.3. Постановка ПЦР в реальном времени 53
2.4.4. Статистическая обработка данных по генной экспрессии 55
2.5 Анализ данных полногеномных микрочипов 55
2.5.1. Получение данных с чипов 55
2.5.2. Способы сравнения данных, выбор контрольных групп 55
2.5.3. Функциональный анализ полученных с микрочипов данных по изменению экспрессии генов 56
2.5.4. Доступ к данным исследования в интернете 57
Глава 3. Результаты 58
3.1. Влияние семакса и PGP на экспрессию генов семейства VEGF и их рецепторов в условиях перманентной фокальной ишемии мозга крыс 58
3.2. Изменение экспрессии генов факторов роста в мозге крыс под действием пептидов
3.2.1. Предмет анализа 60
3.2.2. Анализ экспрессии генов через 3ч после окклюзии СМА 61
3.2.3. Анализ экспрессии генов через 24ч после окклюзии СМА 63
3.2.4. Анализ экспрессии генов через 72ч после окклюзии СМА 65
3.3. Полногеномный анализ влияния пептидного препарата семакс на экспрессию генов при сравнении данных первым способом (см. 2.5.3.) 67
3.3.1. Изменение экспрессии генов под действием семакса 67
3.3.2. Определение молекулярной функции белковых продуктов генов, изменивших экспрессию в исследуемых условиях 68
3.3.3. Биологические процессы, статистически достоверно ассоциированные с генами, изменившими уровень экспрессии в ответ на введение семакса 71
3.4. Полногеномный анализ действия трипептида PGP на экспрессию генов при
сравнении данных первым способом 77
3.4.1. Определение функций белковых продуктов генов 77
3.4.2. Биологические процессы, ассоциированные с генами, уровень экспрессии которых меняется в ответ на введение PGP 81
3.5. Анализ транскрипционных профилей клеток коры головного мозга крыс под действием пептидов семакса и Pro-Gly-Pro в условиях ишемии с применением второго способа сравнения данных (24ч vs. 3ч) (см. 2.5.2.) 85
3.5.1. Сравнение данных, полученных при анализе транскриптомов мозга крысы в условиях ишемии и при воздействии семакса и PGP 85
3.5.2. Влияние ишемии и пептидов семакс и PGP на транскрипцию генов, белковые продукты которых определены как участники когнитивных функциях 87
3.5.3. Воздействие ишемии и пептидов семакс и PGP на ткани головного мозга 89
3.5.4. Действие семакса на гены, участвующие в ответе на стресс 91
3.5.5. Влияние пептидов на гены, кодирующие рибосомные белки 92
3.5.6. Воздействие пептидов на транскрипцию генов хемокинов в условиях ишемии 92
3.5.7. Семакс усиливает эффект, оказываемый ишемией на экспрессию генов интерферон-сигнального пути 95
3.5.8. Семакс воздействует на экспрессию генов, ассоциированных с гуморальным иммунным ответом и синтезом иммуноглобулинов, спустя сутки после окклюзии СМА 97
3.5.9. Выборочная проверка полученных с чипов данных методом ПЦР в реальном времени 100
Глава 4. Обсуждение 101
4.1. Выбор временных точек для анализа экспрессии генов 101
4.2. Изменение экспрессии генов семейства VEGF в экспериментальных условиях 101
4.3. Воздействие семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста
4.3.1. Воздействие ишемии на экспрессию генов факторов роста 105
4.3.2. Изменение экспрессии генов факторов роста под воздействием семакса после окклюзии СМА 107
4.3.3. Эффекты PGP на экспрессию генов факторов роста после окклюзии СМА 110
4.4. Полногеномный транскриптомный анализ влияния семакса на экспрессию генов,
кодирующих белки иммунной и сосудистой систем (сравнение данных относительно
ишемии) 111
4.4.1. Различие профилей экспрессии генов через 3 и 24ч после окклюзии СМА при введении семакса 111
4.4.2. Отклик иммунной системы на введение семакса 112
4.4.3. Ответ сосудистой системы на введение нейропептида семакс 115
4.5. Трипептид PGP влияет на экспрессию генов в условиях фокальной ишемии мозга крыс 116
4.5.1. Изменение экспрессии генов и определение функций их белковых продуктов 116
4.5.2. Биологические процессы, ассоциированные с генами, уровень экспрессии которых меняется в ответ на введение PGP 118
4.6. Новые эффекты действия семакса и PGP на биологические процессы и сигнальные пути 120
4.6.1. Сравнение транскриптомных профилей «ишемия», «ишемия+семакс» и «ишемия+PGP» 120
4.6.2. Влияние ишемии и пептидов семакс и PGP на транскрипцию генов, белковые продукты которых определены как участники когнитивных функций 121
4.6.3. Снижение клеточной гибели в тканях головного мозга под действием семакса в условиях окклюзии СМА 122
4.6.4. Действие семакса на гены, участвующие в ответе на стресс 124
4.6.5. Сравнение влияния ишемии и семакса в условиях ишемии на транскрипцию генов, кодирующие рибосомные белки 125
4.6.6. Введение пептидов меняет набор экспрессирующихся при ишемии генов, кодирующих хемокины 126
4.6.7. Нейропротективный механизм действия интерферонов и его участие в эффектах семакса 128
4.6.8. Усиление активности гуморального иммунного ответа под воздействием семакса в течение первых суток после окклюзии СМА 130
Заключение 132
Выводы 136
Список сокращений 138
Словарь терминов 139
Список литературы 141
