Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Классификация аденовирусов 9
1.2 Структурные особенности аденовирусов 11
1.3 Организация генома аденовирусов 15
1.4 Жизненный цикл аденовирусов
1.4.1 Взаимодействие аденовируса с рецепторами клеточной поверхности 23
1.4.2 Проникновение аденовирусов в клетку 25
1.4.3 Транспорт генома аденовируса в ядро клетки-хозяина 26
1.4.4 Особенности репликации генома аденовируса 26
1.4.5 Сборка вирусных частиц и выход вируса из клетки
1.5 Заболевания, вызываемые аденовирусами человека 30
1.6 Противоаденовирусные препараты 31
1.7 РНК-интерференция
1.7.1 История открытия РНК-интерференции 34
1.7.2 Механизм РНК-интерференции
1.8 Проблемы применения и доставки малых интерферирующих РНК 39
1.9 Химические модификации РНК 41
1.10 Доставка малых интерферирующих РНК в клетки-мишени
1.10.1 Липидные системы доставки 45
1.10.2 Лентивирусные векторы 49
2 Материалы и методы 51
2.1 Материалы 51
2.1.1 Линии клеток 51
2.1.2 Плазмиды 51
2.1.3 Вирусы 52
2.1.4 Реактивы 52
2.1.5 Растворы 55
2.1.6 Пластиковая посуда, другие материалы 58
2.1.7 Оборудование 58
2.2 Методы 59
2.2.1 Культивирование клеток 59
2.2.2 Пассирование перевиваемых культур клеток млекопитающих з
2.2.4 Трансформация компетентных бактериальных клеток E.coli DH5-a 61
2.2.5 Малые интерферирующие siРНК 61
2.2.6 Гибридизация химически синтезированных олигорибонуклеотидов 64
2.2.7 Трансфекция siРНК-дуплексов 64
2.2.8 Малые шпилечные shРНК 65
2.2.9 Получение псевдолентивирусных частиц 65
2.2.10 Определение титра псевдолентивирусных частиц 66
2.2.11 Трансдукция клеток псевдолентивирусными частицами 66
2.2.12 Селекция клеток, трансдуцированных псевдолентивирусными частицами 67
2.2.13 Получение модельных сублиний методом предельных разведений 67
2.2.14 Выделение суммарной РНК из клеток перевиваемых культур 68
2.2.15 Переосаждение суммарной РНК 69
2.2.16 Обратная транскрипция - построение цепей кДНК 70
2.2.17 Полимеразная цепная реакция в реальном времени 70
2.2.18 Определение количества копий генома аденовируса человека методом количественной ПЦР 71
2.2.19 Проточная цитофлуориметрия 72
2.2.20 Вестерн-блот 73
2.2.21 Тест МТТ 76
2.2.22 Определение инфекционности аденовирусного потомства 76
2.2.23 Исследование антивирусной активности соединений 77
2.2.24 Статистическая обработка результатов 77
3 Результаты и обсуждение 78
3.1 Получение модельных линий клеток, геном которых содержит ген ДНК-полимеразы
pol-D36 или Е1А-D36 аденовируса типа 36 человека 78
3.1.1 Внесение последовательностей экспрессирующих кассет «промотор - целевой ген - IRES - маркерный ген флуоресцентного белка dTomato» в геном клеток-мишеней 79
3.1.2 Оценка уровня экспрессии генов pol-D36 и E1A-D36 в клетках модельных линий 81
3.2 Подавление экспрессии генов pol и Е1А аденовируса группы D типа 36 человека с
помощью siРНК в клетках модельных линий 85
3.2.1 Дизайн последовательностей siРНК 86
3.2.2 Оценка эффективности подавления экспрессии гена pol-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий 86
3.2.3 Оценка эффективности подавления экспрессии гена E1A-D36 с помощью siРНК в клетках модельных линий 88
3.3 Подавление экспрессии гена pol-D36 с помощью модифицированных siРНК 91
3.4 Подавление экспрессии генов pol и Е1А аденовирусов группы D человека с помощью лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК
3.4.1 Получение лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК 94
3.4.2 Оценка эффективности подавления экспрессии гена pol-D36 c помощью лентивирусных векторных частиц, кодирующих shРНК 95
3.4.3 Подавление экспрессии гена E1A-D36 с помощью лентивирусных частиц, кодирующих shРНК 97
3.4.4 Подавление репликации аденовирусов группы D человека с помощью shРНК 98
3.5 Противоаденовирусная активность 5-амино производных урацила 100
Заключение 105
Выводы 107
Список сокращений 108
Благодарности 111
