Введение
ГЛАВА 1. Методы идентификации микроорганизмов 9
1.1. Идентификация микроорганизмов, основанная на фенотипических методах 9
1.2. Идентификация микроорганизмов, основанная на генотипических методах 12
1.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК 12
1.2.2. ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация 12
1.2.3. Секвенирование белков и нуклеиновых кислот 13
1.2.4. Использование ДНК-зондов для обнаружения бактерий и изучения состава микробных популяций 18
1.2.5. Краткая характеристика бактериального генома 21
1.2.6. Использование ПЦР со специфичными праймерами для обнаружения и идентификации бактерий 22
1.2.7. ДНК-фингерпринтинг 27
ГЛАВА 2. Характеристика отдельных групп бактерий 3S
2.1 Фитопатогенные бактерии родаXanthomonas 38
2.1.2. Генетические взаимоотношения внутри видаX campestris 41
2.2. Бактерии группы Bacillus cereus 46
2.2.1. Энтомопатогенные бактерии вида Bacillus thuringiensis 47
2.2.2. Методы идентификации и классификации бактерий вида Bacillus thuringiensis 49
2.2.3. Методы, используемые для идентификации cry генов 51
ГЛАВА 3. Материалы и методы исследования 53
3.1. Объекты исследования 53
3.2. Выделение препаратов ДНК из биомассы 57
3.3. ПЦР со специфическими праймерами к cryl, сгуЗ и сгу4 генам 57
3.4. ПЦР с KRP и KRPN праймерами 59
3.5. ПЦР с использованием праймеров к различным повторяющимся элементам 60
3.6. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе 60
3.7. Филогенетический анализ 61
3.8. Клонирование ПЦР-фрагментов 61
3.8.1. Приготовление компетентных клеток 61
3.8.2. Лигирование 62
3.8.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК 64
3.8.4. Выделение плазмидной ДНК 64
3.8.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК 64
3.9. Секвенирование плазмид со вставкой 64
3.9.1. Мечение праймеров 64
3.9.2. Постановка реакции секвенирования 65
3.10. SCAR-ПЦР анализ 66
ГЛАВА 4. Подбор олигонуклеотидных праймеров для проведения DIR-ПЦР .. 67
ГЛАВА 5. Оптимизация условий проведения DIR-ПЦР 68
5.1. Оптимизация условий DIR-ПЦР для бактерий родов Xanthomonas и Bacillus 70
ГЛАВА 6. Изучение генетических взаимоотношений между изолятами Xanthomonas campestris pv. campestris 78
6.1. Сиквенсный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и межгенной области 16S-23SpPHK 78
6.2. Получение видо- и штаммо-специфичных фингерпринтов на ДНК Xanthomonas, выделенных в различных географических ареалах 82
6.3. Фенетический анализ полученных геномных фингерпринтов 87
6.4. Сравнение эффективности DIR-ПЦР и гер-ПЦР при изучении генетического
полиморфизма штаммов Xanthomonas 90
6.5. Разработка и тестирование SCAR праймеров для Xanthomonas campestris 93
ГЛАВА 7. Изучение внутривидового разнообразия энтомопатогенных бактерий вида Bacillus thuringiensis 98
7.1 ПЦР-анализ с использованием праймеров, специфичных к cryl, cry 3 и cry 4 генам 99
7.2. Секвенирование и рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов, соответствующих cry генам 101
7.3. Сиквенсный анализ 5-концевых областей 16S и 23S рРНК и межгенной области 16S-23SpPHK 104
7.4. Изучение энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis методом DIR-ПЦР 105
7.5. ПЦР-анализ энтомопатогенных штаммов В. thuringiensis с применением праймерных систем к мобильным элементам, межгенным повторам и к терминаторным последовательностям 110
7.6. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов энтомопатогенных бактерий вида В. thuringiensis 112
7.7. Разработка и тестирование SCAR праймеров для В. thuringiensis, патогенных в отношении насекомых отряда Lepidoptera 117
ГЛАВА 8. Выявление геномных различий диссоциантов штаммов Bacillus cereus и Bacillus subtilis 122
8.1. Проверка видовой чистоты диссоциантов В. cereus 125
8.1.1. Сиквенсный анализ 5-вариабельной области гена 16S рРНК 125
8.1.2. Проверка диссоциантов В. cereus на наличие cry генов 125
8.2. ПЦР-анализ диссоциантов В. cereus с использованием праймеров к мобильным элементам 126
8.3. Фенетический анализ ПЦР-фингерпринтов диссоциантов В. cereus и В. subtilis 131
ГЛАВА 9. Анализ таксономической надежности и разрешающей способности DIR- ПЦР в сравнении с другими методами ДНК-фингерпринтинга на примере видов Bacillus thuringiensis и Xanthomonas campestris 136
9.1. Анализ штаммов родаXanthomonas 137
9.2. Анализ штаммов ват Bacillus thuringiensis 142
Выводы 147
Список литературы 148
Приложения 164
