Введение
Глава I. Обзор литературы 13
1 Механизмы возникновения резистентности 13
2 Явление компенсаторной пролиферации 14
3 Способы межклеточной коммуникации 16
3.1 Коммуникация, опосредованная белками 16
3.1.1 Механизмы секреции белков 18
3.1.1.1 Секреторная система типа I: образование пор в цитоплазматической мембране 20
3.1.1.1.1 Образование липидных пор при нормальных условиях 20
3.1.1.1.2 Образование пор под действием воспаления 21
3.1.1.2 Секреторная система типа III: секреция с использованием внутриклеточных структур 23
3.1.1.3 Секреторная система типа IV 24
3.2 Коммуникация, опосредованная метаболитами 24
3.2.1 Коммуникация раковых клеток посредством свободных жирных кислот 27
3.2.2 Коммуникация раковых клеток посредством простагландинов 28
3.2.3 Производные сфинголипидов как медиаторы коммуникации между раковыми и стромальными клетками 29
3.3 Циркулирующие РНК 29
3.4 Внеклеточные везикулы 32
4 Использование омиксных технологий в изучении межклеточной коммуникации 34
4.1 Протеомные технологии в изучении онкологических заболеваний 34
4.2 Метаболомные технологии в изучении онкологических заболеваний 37
Заключение 40
Глава II. Экспериментальная часть 41
1 Оборудование и материалы 41
2 Пациенты и биологические образцы 45
3 Получение асцитных жидкостей 47
4 Измерение концентрации белка 47
5 Пробоподготовка для метаболомного анализа 48
6 Масс-спектрометрия, совмещенная с газовой хроматографией 48
7 Обработка комбинаторными гексапептидными лигандными библиотеками 49
8 Электрофорез в полиакриламидном геле 49
9 Трипсинолиз в геле 10 LC-MS/MS анализ 50
11 Анализ LС-MS/MS данных 51
12 Иммуноблоттинг 52
13 Цитокиновое профилирование асцитов 52
14 Выделение экзосом из асцитов 53
15 Выделение РНК из асцитов 53
16 МТТ-тест 54
17 Работа с клеточными культурами 54
17.1 Для протеомных экспериментов 54
17.2 Для экспериментов с мяРНК 55
18 Протеомный анализ секретомов клеток 55
19 Трипсинолиз в растворе 56
20 Проточная цитофлуориметрия 56
21 Фракционирование клеток 57
22 Мечение молекул РНК в клетках-донорах и их детекция в клетках-реципиентах 57
23 Конструирование и синтез аналогов мяРНК 58
24 Получение FITC-меченных мяРНК 59
25 Введение [32Р]-метки по 5 -концу мяРНК 60
26 Трансфекция клеток MCF-7 и SKOV3 аналогами мяРНК 60
27 Выделение суммарной РНК клеток человека 60
28 Анализ накопления флуоресцентно-меченой РНК в клетках человека 61
29 Анализ стабильности радиоактивно меченых аналогов мяРНК в клетках человека 61
30 Анализ изменения уровня экспрессии генов в клетках человека, трансфицированных аналогами мяРНК 62
31 Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста 62
32 Подготовка препаратов суммарной РНК клеток человека для дифференциального анализа экспрессии генов 62
33 Биоинформатический анализ дифференциальной экспрессии генов 63
Глава III. Результаты и их обсуждение 64
1 Изучение асцитов как среды для межклеточной коммуникации 64
1.1 Метаболомный анализ опухолевых асцитов и асцитов от пациенток с циррозом 65
1.2 Протеомный анализ опухолевых асцитов и асцитов от пациенток с циррозом 69
1.2.1 Разработка подхода к фракционированию асцитов 69
1.2.2 NTA анализ показал, что опухолевые асциты обогащены повышенным количеством экзосом 72
1.2.3 Полуколичественный анализ и выявление значимых отличий в опухолевых асцитах по сравнению с контрольными 73
1.3 Полуколичественный анализ и выявление значимых отличий в опухолевых асцитах до и после химиотерапии 75
1.4 Детекция сплайсосомных мяРНК в асцитах 77
1.5 Опухолевые асциты вносят вклад в формирование резистентности de novo 81
2 Секретомы раковых клеток in vitro 84
2.1 Протективный эффект секретомов, индуцированных химиотерапией, на реципиентные раковые клетки 85
2.2 Протеомный анализ секретомов клеток после действия ХТ и ионизирующего излучения 87
2.3 Секретомы раковых клеток, индуцированные химио- и радиотерапией, обогащены компонентами сплайсосомы 89
2.4 Влияние химиотерапии на секрецию неонкотрансформированных клеток 92
2.5 Изменения субклеточного протеома, индуцированные повреждением ДНК 98
3 Выявление роли компонентов сплайсосомы в межклеточной коммуникации раковых новообразований 100
3.1 Сплайсосомные белки и некоторые типы РНК, оказываясь во внеклеточной среде, могут поглощаться реципиентными клетками 100
3.2 Выявление роли внеклеточных сплайсосомальных мяРНК в межклеточной коммуникации злокачественных новообразований 102
3.2.1 Разработка схемы синтеза in vitro РНК-конструкций, несущих последовательности нескольких мяРНК 102
3.2.2 Предотвращение активации неспецифического иммунного ответа в трансфицированных клетках 104
3.2.3 Выбор оптимальных условий трансфекции 106
3.2.4 Выявление механизмов участия циркулирующих во внеклеточном пространстве мяРНК в межклеточной коммуникации 109
3.2.4.1 Анализ дифференциальной экспрессии генов в раковых клетках, трансфицированных синтетическими аналогами мяРНК 109
3.2.4.2 Анализ протеома в раковых клетках, трансфицированных синтетическими аналогами мяРНК 114
Заключение 117
Выводы 119
Список литературы 120
Приложение 1 136
Приложение 2 137
Приложение 3 138
Приложение 4 139
Приложение 5 140
Приложение 6 141
Приложение 7 142
