Введение
1. Обзор литературы 7
1.1 Введение 7
1.2 Прионы млекопитающих 8
1.2.1 Прионы - новый класс инфекционных агентов 8
1.2.2 Инфекционная активность прионов млекопитающих связана с белком PrPSc 11
1.2.3 Молекулярные модели прионного превращения 11
1.3 Прионы низших эукариот 14
1.3.1 Ыехромосомные детерминанты [РБГ], [URE3] и [PIN*] дрожжей 14
1.3.2 Цитопл аз мати ческий детерминант [Het-s] гриба Podospora anserina 19
1.4 Молекулярная природа детерминанта [pst]\ прионные свойства белка SUP35 20
1.4.1 Структура и функция белка Sup35 20
1.4.2 Экспериментальные доказательства прионных свойств белка Sup35 23
1.4.3 Возможность существования [РЗҐ] у других организмов 26
1.4.4 Амилоиды млекопитающих, их сходство с прионными белками дрожжей Sup35iiUre2 27
1.4.5 Амилоидные белки с экспансией полиглутамина, болезнь Хантингтона 28
1.5 Роль шаперонов в поддержании прионного состояния белков 31
1.5.1 Краткий обзор клеточных шаперонов 31
1.5.2 Роль шаперона Hspl04 в поддержании детерминанта [Р5Ґ"] и других прионов 33
1.5.3 Рост клеток на среде с GuHCl приводит к потере прионного фенотипа 34
1.6 Распространённость прионов в природе 35
1.6.1 Биологическое значение прионов 37
1.7 Перспективы лечения прионных заболеваний 42
1.8 Заключение 43
2. Цели и задачи 45
3. Материалы и методы 46
3.1 Штаммы микроорганизмов и генетические методы 46
3.1.1 Штаммы дрожжей 46
3.1.2 Штаммы бактерий 46
3.1.3 Культура клеток человека 46
3.2 Среды и условия культивирования микроорганизмов 46
3.2.1 Среды для выращивания Е. соМ 46
3.2.2 Среды для выращивания S. cerevisiae 47
3.3 Трансформация микроорганизмов 47
3.4 Генетические методы 49
3.4.1 Генетическая система для детекции прнонных фенотипов 49
3.5 Конструирование гошмидных днк 50
3.6 Биохимические методы 52
3.6.1 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 52
3.6.2 Приготовление дрожжевых лизатов 53
3.6.3 Метод полуденатурирующего агарозиого электрофореза (SDD AGE) 54
3.6.3 Фракционирование дрожжевых лизатов 56
3.6.4 Электрофорез в ПААГ и иммуноблоттинг 56
4. Результаты 57
4.1 Анализ структурных свойств прионных агрегатов белка sup35 методом полуднатурирующего электрофореза 57
4.1.1 В клетках [Р57*] прионные агрегаты состоят из полимеров белка Sup35 57
4.1.2 Уменьшение уровня Hspl04 приводит к увеличению размера приопных полимеров из-за блокирования фрагментации 63
4.1.3 GuHCl блокирует фрагментацию полимеров белка Sup35 65
4.1.4 Сверхэкспрессия Hspl04 приводит к увеличению размера полимеров белка Sup35 67
4.2 Анализ агрегатов различных прионоподобных белков 69
4.2.1 Прионоподобные агрегаты белков Rnql, Sup35PS, Publ и Q103 состоят из SDS-устойчивых полимеров 69
4.3 Анализ искусственных прионов, сконструированных на основе голиглутамина, и их сравнение с SUP35 71
4.3.1 Прионоподобные характеристики Q70, Q85 и QY76 73
4.3.2 Размер прионных полимеров белков Q70 и QY76 зависит от активности шаперона Hspl04 75
4.3.3 Присутствие GuHCI в среде приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70 и QY76 77
4.3.4 Сверхпродукция шаперона Hspl04 приводит к увеличению размера прионных полимеров белков Q70, Q85 и QY76 78
5. Обсуждение 81
5.1 Структурная организация прионов 81
5.2 Паперон hsp104 осуществляет фрагментацию прионных полимеров белка sup35 82
5.3 Разработанный метод электрофоретического анализа полимеров применим для исследования различных амилоидогенных белков 85
5.4 Белки с полиглутаминовыми последовательностями образуют прионоподобные полимеры в клетках дрожжей 87
5.5 Полимеры qy76 фрагментируются с помощью hsp104 87
5.6 Полимеры qy76 могут фрагметироваться независимо othsp104 88
5.7 Полиглутаминовые полимеры фрагментируются с помощью hsp104 89
5.8 Сходства и отличия свойств полимеров, образованных sup35hbemamh polyq/qy 90
5.9 Заключение 92
Выводы 93
