Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Молекулярная биология ВИЧ-1 10
1.2. Проблемы создания вакцины против ВИЧ-1 14
1.2.1. Антигенная изменчивость ВИЧ-1 15
1.2.2. Проблемы тестирования вакцин 16
1.2.3. Значение иммунных механизмов в защите от ВИЧ-инфекции 17
1.2.4. Механизмы иммуносупрессии и имуннопатологии при ВИЧ-инфекции 19
1.3. Традиционные стратегии вакцинации 21
1.3.1. Стратегии вакцинации, основанные на использовании аттенуировашюго вируса 22
1.3.2. Стратегии вакцинации, основанные на использовании инактивированного вируса 22
1.3.3. Стратегии вакцинации, основанные на использовании рекомбинантных вирусных белков 23
1.4. Новые нетрадиционные стратегии вакцинации, основанные на использовании синтетических полиэпитопных иммуногенов 24
1.4.1. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования плазмидной ДНК 24
1.4.2. Системы доставки вакцинных конструкций на основе использования живых рекомбинантных векторов 25
1.4.3. Дизайн полиэпитопных иммуногенов 27
1.4.4. Синтез генов, кодирующих полиэпитопные иммуиогены 30
1.5. Вакцинный иммунитет и клиническое заболевание 31
1.6. Биологическое тестирование CTL-вакцип 32
1.6.1. Тестирование иммуногенности вакцин 32
1.7. Заключение по обзору литературы 34
2. Материалы и методы 36
2.1. Клетки, плазмиды, ферменты, питательные среды, олигоиуклеотиды 36
2.2. Экспрессия гена TCI в клетках E.coli 36
2.3. Трансфекция COS- клеток 37
2.4. ОТ-ПЦР РНК, выделенной из COS клеток 37
2.5. Получение поликлональной сыворотки к белку TRX-TCI 37
2.6. Определение ВИЧ-антигениости рекомбинантных белков GST-TCI и TRX-TCI методами ФА и иммуноблот-гибридизации 38
2.7. Получение плазмиды для клонирования гена ТСІ в эукариотической системе 38
2.8. Иммунизация мышей 39
2.9. Определение пролиферации Т-лимфоцитов 39
2.10. Определение титров антител с помощью ИФА 40
2.11. Определение количества CTL с помощью реакции ELISPOT 40
3. Результаты 41
3.1. Дизайн искусственного иммуногена, содержащего множественные CTL-эпитопы основных антигенов ВИЧ-1 41
3.2. Конструирование искусственного гена 46
3.3. Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии гена ТСІ в прокариотической и эукариотической системах 58
3.3.1. Получение рекомбинантных плазмид, эксирессирующих ген ТСІ в Е.соН 58
3.3.2. Получение рекомбинантной плазмиды, экспрессирующих ген ТСІ в эукариотической системе 59
3.4. Анализ экспрессии гена по определению синтеза специфической мРЫК 65
3.5. Иммунохимическое исследование продукта гена ТСІ 66
3.6. Исследование иммуногенностй плазмидной ДНК, кодирующей белок ТСІ 66
3.6.1. Оценка количества цитотоксических Т-лимфоцитов иммунизированных животных 67
3.6.2. Оценка пролиферативной активности спленоцитов иммунизированных животных 68
3.6.3. Исследование титров антител в сыворотках крови иммунизированных животных 70
4. Обсуждение 72
Выводы 77
