Введение
Обзор литературы 8
1.1 Фитогормоны 8
1.1.1. Цитокинины 9
1.1.1.1. Структурно-функциональные свойства цитокининов 9
1.1.1.2. Биосинтез цитокининов 14
1.1.1.2.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов (de novo) 14
1.1.1.2.2. Биосинтез цитокининов через тРНК 16
1.1.1.3. Метаболизм цитокининов в растениях 20
1.1.1.3.1. Конъюгация цитокининов 21
1.1.1.3.2. Деградация цитокининов 23
1.1.1.4. Рецепция, передача сигнала, транспорт и регуляторная роль цитокининов 25
1.1.2. Ауксины 27
1.1.2.1. Открытие, структура и физиологические свойства ауксинов 27
1.1.2.2. Биосинтез ИУК, метаболизм и транспорт ауксинов 29
1.1.2.3. Рецепция ауксинов и регуляция ауксинами экспрессии генов 31
1.3. Агробактериальные гены биосинтеза цитокининов и ауксинов 32
1.4. Трансгенные растения с генами биосинтеза цитокининов и ауксинов агробактерий 35
1.4.1. Трансгенные растения с геном ipt 36
1.4.2. Трансгенные растения с генами биосинтеза ауксинов іааМи іааН. 37
2. Материалы и методы 41
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 41
2.1.1. Условия культивирования бактерий 42
2.2. Растения 43
2.3. Среды 43
2.3.1.Среды для культивирования растений 43
2.3.2. Микробиологические среды 43
2.4. Реактивы, растворы и ферменты 45
2.5 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК 45
2.6. Введение метки в ДНК 46
2.7. Выделение суммарной растительной ДНК 46
2.8. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 46
2.9. Гибридизация ДНК на фильтрах по Саузерну 47
2.10. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола47
2.11. РНК-ДНК гибридизация 48
2.12. ПЦР-анализ рекомбинантных бактерий и трансгенных растений 48
2.13. Определение степени метилирования ДНК 49
2.14. Трансформация листовых дисков табака 49
2.15. Определение активности неомицинфосфотрансферазы II (NPT И) 50
2.16. Экстракция цитокининов из растительного материала 50
2.17. Экстракция и очистка ауксинов из растительного материала 51
2.18. Биотест на содержание ауксинов с помощью колеоптилей пшеницы 51
2.19. Стерилизация семян табака 52
2.20. Определение содержания хлорофиллов и каротиноидов в листьях 52
2.21. Измерение С02-газообмена 52
2.22. Измерение флуоресценции хлорофилла в листьях растений 52
2.23. Определение растворимого белка и углеводов в листьях табака 53
2.24. Определение листовой поверхности листьев и общего сухого веса листьев. 53
2.25. Колонизация растений ассоциативными метилотрофными бактериями Methylovorus mays 54
2.26. Выделение хлоропластов 54
2.27. Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода 54
2.28. Анализ устьиц 54
2.29. Прививка растений 55
2.30. Искусственное переопыление трансгенных растений табака 55
3. Результаты и их обсуждение 56
3.1.Создание и изучение трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих агробактериальный ген биосинтеза цитокининов 56
3.1.1. Конструирование рекомбинантных плазмид с геном ipt под контролем одинарного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) 56
3.1.2. Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum генетическими конструкциями с агробактериальными геном биосинтеза цитокининов 59
3.1.3. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с генами биосинтеза цитокининов 62
3.1.4. Морфолого-биохимические характеристики растений с повышенным синтезом цитокининов 64
3.1.4.1. Анализ содержания цитокининов в ipt-растениях 64
3.1.4.2. Вариабельность фенотипов ipt-растений 65
3.1.5. Анализ метилирования ДНК в ipt-растениях табака 68
3.1.6. Изучение влияния цитокининов на ipt-растения и их экспланты в нормальных условиях и при действии стрессовых факторов 72
3.2. Получение и анализ трансгенных растений с геном iaaM 76
3.2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген iaaM под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35SS) 76
3.2.2. Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum генетическими конструкциями, содержащими агробактериальный ген биосинтеза ауксинов 79
3.2.3. Молекулярно-генетический анализ растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с геном iaaM. 80
3.2.4. Морфолого-биохимические характеристики растений с повышенным синтезом ауксинов 82
3.2.4.1. Анализ роста іааМ-растений в условиях in vitro 82
3.2.4.2. Анализ роста и развития іааМ-растений в условиях закрытого грунта 83
3.2.4.3. Определение уровня эндогенных ауксинов 85
3.2.4.4. Репродуктивные свойства іааМ-растений и анализ первого поколения трансгенных растений 87
3.3. Изучение фотосинтетических параметров в трансгенных растениях с генами ipt и iaaM. 90
3.4. Изучение химерных трансгенных растений табака с различным уровнем ауксинов и цитокининов 96
3.5. Исследование антисмыслового ингибирования генов биосинтеза фитогормонов в трансгенных растениях табака 100
Заключение 107
