Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. РНК-полимеразная активность ядер. 8
1.1.1. Общая характеристика 8
1.1.2. Действие ингибиторов на РБК-полимеразную активность ядер 10
1.1.3. Внутриядерная локализация РНК-полимеразных активностей 13
1.2. Разделение и очистка множественных форм ДНК-за висимых РНК-полимераз 15
1.2.1. Экстракция ферментов 15
1.2.2. Разделение форм ДНК-зависимых РНК-полимераз 17
1.2.3. Очистка ДНК-зависимых РНК-полимераз 21
1.3. Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз 26
1.3.1. Оптимальные условия реакции 26
1.3.2. Зависимость активности от концентрации субстратов 29
1.3.3. Действие ингибиторов на ядерные РНК-полимеразы 32
1.4. Субъединичное строение ядерных ДНК-зависимых РНК-полимераз 36
1.4.1. Большие субъединицы 37
1.4.2. Мелкие субъединицы 46
1.4.2.1. Субъединицы, общие для всех трех классов. РНК-полимераз 49
1.4.2.2. Субъединицы, общие для двух классов РНК-полимераз 51
1.4.3. Субъединицы промежуточного размера 52
2. Материалы и методы 56
2.1. Объект исследования 56
2.2. Культивирование 56
2.3. Выделение субклеточных структур 57
2.3.1. Выделение ядер в изотонической среде 57
2.3.2. Выделение ядер в гипертонической среде 58
2.3.3. Выделение ядрышек 58
2.4. Выделение и очистка ферментов 59
2.4.1. Экстракция ферментов из ядер 59
2.4.2. Разделение форм РНК-полимеразы 59
2.4.3. Аффинная хроматография РНК-полимераз 60
2.4.3.1. Синтез аффинных сорбентов 60
2.4.3.2. Очистка РНК-полимераз на аффинных сорбентах 61
2.4.4. Гель-фильтрация РНК-полимераз 61
2.5. Методы получения ДНК 62
2.5.1. Выделение ядерной ДНК 62
2.5.2. Получение различных форм ДНК плазмиды рСО 52 63
2.5.3. Электрофорез ДНК 63
2.6. Определение активностей ферментов 64
2.6.1. Определение активности ДНК-зависимых РНК-полимераз 64
2.6.2. Определение РНК-полимеразной активности субклеточных структур 64
2.6.3. Определение нуклеазных активностей 65
2.7. Определение молекулярной массы белков 66
2.7.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в неде-натурирующих условиях 66
2.7.2. Гель-фильтрация на колонках с сефакрилом S -300 68
2.7.3. Электрофорез в полиакриламидном геле в дена турирующих условиях 68
2.8. Определение содержания белка и ДНК 69
3. Результаты и их обсудцение 70
3.1. РНК-полимеразная активность ядер 70
3.2. Внутриядерная локализация РНК-полимеразных активностей 75
3.3. Выделение ДНК-зависимых РНК-полимераз 79
3.3.1. Разделение форм ДНК-зависимой РНК-полимеразы 81
3.3.2. Аффинная хроматография РНК-полимераз 86
3.3.3. Очистка РНК-полшлераз при помощи гель-фильтрации 87
3.3.4. Очистка РНК-полимераз с использованием сефакрила S-300 91
3.4. Свойства ДНК-зависимых РНК-полимераз 95
3.4.1. Влияние матрицы на активность РНК-полимераз 102
3.4.2. Зависимость активности от субстратов 105
3.5. Структура ДНК-зависимых РНК-полимераз Crithidia oncopelti 109
3.5.1. Размеры молекул ферментов 109
3.5.2. Субъединичная структура РНК-полимераз 114
Заклшение 123
