Введение
1. Обзор литературы 8
1.Весенняя виремия карпа 8
1. Историческая справка 8
2. Предрасполагающие факторы, группы риска 10
3. Клиническая картина 1І
4. Возбудитель заболевания - вирус весенней виремии карпа 12
4.1. Структура вируса 13
4.2. Гликопротеин (G-белок) рабдовирусов 15
5. Существующие подходы к профилактике и лечению ВВК 18
2. Вакцинология в аквакультуре 19
1. Традиционные инактивированные и аттенуированные вакцины для рыб 20
2. Рекомбинантные технологии в аквакультуре 21
2.1. Субъединичные вакцины для рыб 23
2.2. ДНК-вакцины 25
2.2.1.Опыт применения ДНК-вакцин для рыб 27
2.2.2. Возможные системы доставки вакцины в организм рыбы 29
2.2.3. Исследование тканевого распределения плазмидной ДНК и продолжительности экспрессии рекомбинантног гена в организме рыб 33
2.2.4. Изучение механизмов представления АГ клеткам ИС после введения ДНК-вакцин 35
2.2.5. Иммунный ответ
2.2.6. Исследование безопасности ДНК-вакцин 43
2. Материалы и методы
2.1.Реактивы 47
2.2. Ферменты 47
2.3.0лигонулеотиды 47
2.4.Плазмиды 47
2.5. Бактерии 48
2.6. Культуральные среды 48
2.7. Вирусы и клетки 48
2.9. Растворы 49
2.9. Методы
2.9.1. Выделение вирусной РНК 49
2.9.2. Синтез ДНК, комплементарной вирусной РНК 49
2.9.3. Амплификация фрагментов ДНК 50
2.9.4. Элюция фрагментов ДНК 50
2.9.5. Коструирование рекомбинантных ДНК 51
2.9.6. Трансформация клетокІ?. Coli плазмидной ДНК 51
2.9.7. Выделение плазмидной ДНК 51
2.9.8. Ферментативный гидролиз ДНК 52
2.9.9. Электрофоретическое фракционирование ДНК 53
2.9.10.Анализ первичной структуры ДНК 53
2.9.11 ГЭлектрофоретический анализ белка 54
2.9.12.Получение иммунной сыворотки 55
2.9.13.Иммуноферментньій анализ 55
2.9.14.Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками 55
2.9.15.Приготовление препарата субъединичной ваіщиньї для иммунизации 55
2.9.16.Оценка протективности экспериментальных вакцин 56
2.9.17.Оценка иммуногенности экспериментальных вакцин 57
3. Результаты и обсуждение 58
3.1 .Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин вируса весенней виремии карпа американского изолята 59
3.1.1. Рекомбинантная конструкция pcDNA-G-a 5 9
3.1.2. Конструирование рекомбииаитной плазмидной ДНК pQE-G для экспрессии гена гликопротеина вируса в E.coli - субъединичная вакцина 59
3.1.3. Исследование продукции рекомбинантного вирусного гликопротеина в клетках Е. coli 60
3.1.4. Иммуногенность экспериментальных вакцин 64
3.1.5. Защитные свойства экспериментальных вакцин 68
3.1.5.1. Эффективность экспериментальной ДНК-вакцины 71
3.1.5.2. Эффективность субъединичной вакцины 73
3.1.6. Влияние изменения дозы вводимой плазмидной конструкции и неспецифических иммуностимуляторов на эффективность ДНК-вакцинации 76
3.2. Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие гликопротеин референтного для России изолята вируса весенней виремии карпа 84
3.2.1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-G-3J14 - кандидатной ДНК-вакцины 84
3.2.2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBACarpVax-G-3JI4 - кандидатная ДНК-вакцина 89
3.2.3. Продукция рекомбинантного вирусного гликопротеина в культуре клеток 90
3.2.4. Защитные свойства в акции-кандидатов, кодирующих гликопротеин референсного для России изолята вируса весенней виремии карпа 92
3.3. Генно-инженерные плазмидные ДНК - кандидатные вакцины, кодирующие нуклеопротеин россйского изолята вируса весенней виремии карпа 95
3.4. Влияние повышенной температуры воды и ридостина на эффективность ДНК-вакцинации 100
Заключение 106
