Введение
1. Утилизация железа 9
1.1. Значение железа для бактерий 9
1.2. Сидерофоры 9
1.2.1. Характеристика сидерофоров 9
1.2.2. История открытия сидерофоров 10
2. Утилизация железа в бактериях рода Yersinia 11
2.1. Особенности строения энтеробактерий 11
2.2. Род Yersinia 12
2.3. Системы утилизации железа в Y. enterocolitica 13
2.4. Транслокация сидерофоров через клеточные мембраны 14
2.5. Депонирование железа 15
2.6. Железо как регулятор 15
2.7. Йерсиниабактин 16
2.8. Остров патогенности (High Pathogenicity Island, НРІ) 17
3. YbtA 19
3.1. Семейство AraC/XilS 19
3.2. YbtA, известные на сегодняшний день факты и предположения 20
3.2.1. Биохимическая характеристика YbtA 20
3.2.2. YbtA-регулируемые промоторы 22
3.2.3. ERIC элемент промоторам/Л Y. enterocolitica 24
2 Материалы и методы 26
1. Материалы. 26
1.1. Оборудование 26
1.2. Химикалии и ферменты 27
2. Бактерии, плазмиды и п рай меры 27
2.1. Бактерии 27
2.2. Праймеры 28
2.3. Плазмиды 29
3. Бактериальные среды и антибиотики, использованные в работе 30
3.1. Бактериальные среды 30
3.2. Антибиотики 31
4. Работа с бактериями 31
4.1. Условия роста 31
4.2. Трансформация клеток 33
4.3. Хранение культур 32
5. Использованные стандартные молекулярно-биологическис и биохимические методы 32
5.1. Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР) 32
5.2. Выделение и очистка ДНК 32
5.2.1. Выделение хромосомальной ДНК 32
5.2.2. Выделение плазмид 32
5.2.3. Выделение ПЦР-фрагментов 32
5.3. Выделение РНК и реакция удлинения п рай мера 33
5.3.1. Выделение РНК 33
5.3.2. Реакция удлинения праймера 33
5.4. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот 33
5.4.1. Измерение концентрации ДНК и РНК 33
5.4.2. Измерение концентрации белка 34
5.5. Энзиматическая модификация ДНК 34
5.5.1. Сайт-специфическая рестрикция 34
5.5.2. Лигация 34
5.6. Электрофоретический анализ ДНК и белков 34
5.6.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле 34
5.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 35
6. Конструирование экспрессионной плазмиды рЕТЗс-YbtA 35
7. Очистка YbtA 36
7.1. Экспрессия YbtA в Е. coli 36
7.2. Хроматографическая очистка YbtA 37
8. Конструирование репортерных плазмид для изучения экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлинения праймера 38
8.1. Конструирование репортерных плазмид, несущих оригинальные промоторы генов HPI 38
8.2. Внесение делений в промоторы репортерных плазмид 40
9. ПЦР - амплификация промоторных фрагментов для EMSA и DNasel футпринтннга 41
10. Очистка йерснннабактнна 42
10.1. Биосинтез и очистка йерсиниабактина 42
10.2. Анализ йерсиниабактина 42
11. Анализ изменения электрофоретнческой подвижности 43
12. Определение флуоресценции CFP при репортерном анализе 43
13. DNase І футпринтинг. 44
14. Выравнивание защищенных областей 44
3 Результаты и обсуждение 45
1. УЫА-зависимые промоторы НР1 45
1.1. Точки начала транскрипции YbtA-зависимых промоторов HPI 45
1.2. -10 и -35 последовательности YbtA-зависимых промоторов HPI 46
2. Взаимодействие YbtA с промоторами-мишенями 49
2.1. Выделение YbtA 49
2.2. Взаимодействие YbtA с промоторами - мишенями 50
2.2.1. Комплексы YbtA-ДНК, формируемые промоторами HPI 50
2.2.2. Специфические YbtA - связывающие участки 51
3. Участие йерснннабактнна в регуляции YbtA-зависимых промоторов 56
3.1. Выделение йерсиниабактина 56
3.2. Влияние йерсиниабактина в среде на активность YbtA-зависимых промоторов 57
3.3. Опенка влияния йерсиниабактина на взаимодействия YbtA и ДНК 58
3.4. Оценка возможности связывания YbtA и Ybt-Fe комплекса 59
4. ERIC-элемент промоторов ігрб и ybtA Y. enterocolitica 61
4. Влияние ERIC-элемента на экспрессию с промоторов ігрб и ybtA 61
5 Функция сайтов связывания YbtA RSI. RS2 и RS3 в регуляции промоторов rht.4 и ігрб 64
5.1. Участие сайтов связывания YbtA в формировании комплексов с промоторами ігрб и ybtA 65
5.2. Влияние делеций сайтов связывания YbtA на транскрипционную активность промоторов ігрб и ybtA 67
6. Влияние компонентов системы утилизации железа на работу дивергентных промоторов ybtA и ігрб 72
6.1. Экспрессия промоторов в мутантах дефективных по различным компонентам системы утилизации железа 72
Обсуждение 73
Заключение 74
