Введение
CLASS Обзор литератур CLASS ы 8
1. Общая схема зрительной трансдукции 8
1.1. Строение глаза, сетчатки и фоторецепторных клеток 8
1.2. Морфология и состав наружных сегментов палочек 14
1.3. Передача зрительного сигнала 18
1.4. Восстановление темнового состояния фоторецепторной клетки. 19
2. Рековерин 22
2.1. Тканевая и клеточная локализация 23
2.2. Ген и первичная структура 24
2.3. N-концевое ацилирование 25
2.4. Са2+-связывающие центры рековерина . 25
2.5. Са2+-зависимое взаимодействие рековерина с фоторецепторными мембранами 29
2.6. Ортологи и гомологи рековерина 32
3. Родопсинкиназа 40
3.1. Ген и тканевая локализация родопсинкиназы 41
3.2. Характеристика доменов родопсинкиназы и посттрансляционные модификации 42
3.3. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и ее активация. 44
3.4. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой 49
3.5. «Фосфорилирование родопсина с высоким выходом» 51
4. Рековерин как Са2+-сенсор родопсинкиназы 53
Материалы и методы 57
1. Материалы и реактивы 57
2. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 57
3. Мутагенез с помощью полимеразной цепной реакции 58
4. Отбор мутантных клонов 59
5. Секвенирование ДНК 59
6. Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках E.coli 60
7. Выделение рекомбинантного рековерина дикого типа и его мутантных форм 60
8. Приготовление кальциевых буферов и измерение [Са ]free 62
9. Определение количества кальция, связанного с рековерином 62
10. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки 63
11. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран 64
12. Связывание рекомбинантного рековерина и его мутантных форм с отмытыми мочевиной фоторецепторными мембранами 65
13. Выделение родопсинкиназы 65
14. Определение активности родопсинкиназы 66
15. SPR-спектроскопия 67
15.1. Приготовление и иммобилизация липосом 67
15.2. Измерение связывания рековерина и его мутантных форм с SPR-чипом. Обработка экспериментальных данных 68
16. Аналитические процедуры 69
16.1. Определение концентрации белков 69
16.2. SDS-электрофорез в полиакриламидном геле 70
16.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле 70
Результаты и их обсуждение 71
1. Получение мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру (EF+4) и одновременно с нарушенной Са2+ -связывающей способностью у EF2 (EF-2+4) и EF3(EF-3+4) 72
1.1. Клонирование мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 72
1.2. Экспрессия мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 76
1.3. Выделение мутантов рековерина EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 77
2. Связывание ионов кальция мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са -связывающему центру...78
2.1. Мутант EF+4 79
2.2. Мутант EF-2+4 81
2.3. Мутант EF-3+4 82
3. Са2+-зависимое взаимодействие мутантов рековерина, модифицированных по четвертому Са2+-связывающему центру, с фоторецепторными мембранами 87
4. Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы мутантами рековерина, модифицированными по четвертому Са2+-связывающему центру 93
5. Изучение взаимодействия мутантов рековерина по четвертому Са2+-связывающему центру с иммобилизованным липидным бислоем методом SPR-спектроскопии 99
5.1. Принцип метода SPR-спектроскопии 100
5.2. Применимость метода SPR-спектроскопии для изучении взаимодействия мутанта рековерина EF+4 с иммобилизованным липидным бислоем 101
5.3. Изучение зависимости взаимодействия мутанта EF+4 с липидным бислоем, иммобилизованным на SPR-чипе, от концентрации ионов кальция и белка 104
5.4. Кинетика диссоциации мутантов EF+4, EF-2+4 и EF-3+4 из комплекса с липидным бислоем, иммобилизованным на SPR-чипе. 109
Выводы 120
Список литературы 122
