Введение
1. Вирус иммунодефицита человека первого типа 12
1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вирус 12
1.2. Анти-ВИЧ иммунный ответ 14
1.2.1. Гуморальный иммунитет 14
1.2.2. Клеточный иммунитет 16
1.2.3. Мукозальный иммунитет 17
2. Вакцины против ВИЧ/СПИД 19
2.1. Вакцины на основе аттенуированных вирусов 19
2.2. Субъединичные вакцины 20
2.3. Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ-1 иммуиогенов 21
2.4. ДНК-вакцины 27
3. Способы доставки вакцинных препаратов 31
3.1. Микросферы 31
3.2. Вакцины на основе рекомбианантных вирусных векторов 33
3.3. Аттеиуированные штаммы сальмонелл в качестве системы доставки антигенов 34
2. Материалы и методы 41
2.1. Реактивы 41
2.2. Ферменты 41
2.3. Плазмиды 41
2.4. Бактерии 42
2.5. Культуральные и питательные среды 42
2.6. Вирусы 42
2.7. Растворы 43
2.8. Методы
2.8.1. Трансформация клеток Е.соїі плазмидной ДНК 43
2.8.2. Трансформация клеток сальмонеллы плазмидной ДНК 43
2.8.3. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8.4. Ферментативный гидролиз ДНК 45
2.8.5. Электрофоретическое фракционирование ДНК 45
2.8.6. Элюция фрагментов ДНК из ПААГ 45
2.8.7. Конструирование рекомбинантных ДНК 46
2.8.8. Электрофоретический анализ белка 46
2.8.9. Иммуноблотинг белков с иммунными сыворотками 46
2.8.10. Иммунизация лабораторных животных 47
2.8.11. Определение ЛД5о аттенуированных штаммов сальмонеллы при перректальном введении 48
2.8.12. Исследование антигенной структуры сальмонелл 48
2.8.13. Исследование персистенции сальмонелл в органах лабраторных животных 48
2.8.14. Иммуноферментньтй анализ 49
2.8.15. Реакция бласттрансформации 49
2.8.16. Определение специфических IFN-y-продуцирующих клеток в реакции ELISPOT 50
2.8.17. Реакция вирусной нейтрализации 50
З.Результаты и обсуждение 53
3.1. Использование вирусоподобных частиц для доставки искуствеиного белка TBI 54
3.1.1. Получение гибридного белка GST-TBI и анализ его антигенных свойств 55
3.1.2. Получение вирусоподобной конструкции каидидатной вакцины 57
3.1.3. Конструирование ВПЧ. несущих ДНК вакцину pcDNA-TBI 61
3.2. Иммуиогенность экспериментальных вакцин 65
3.2.1. Схема проведения эксперимента 65
3.2.2. Оценка гуморального иммунного ответа 66
3.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных животных 70
3.2.4. Клеточный иммунный ответ при введении экспериментальных вакцин 73
3.3. Использование аттенуированных штаммов сальмонелл в качестве системы доставки искусственного белка TBI 75
3.3.1. Характеристика аттенуированиых штаммов сальмонелл 76
3.3.2. Получение рекомбинантных штаммов сальмонеллы и исследование продукции белка TBI 76
3.3.3. Исследование биохимических и антигенных свойств аттепуированных штаммов сальмонелл 78
3.3.4. Оценка стабильности плазмидных конструкций в клетках сальмонеллы 79
3.3.5 Определение ЛД;() аттенуированиых штаммов сальмонеллы при ректальном введении 79
3.4. Иммуиогениые свойства вакцинных штаммов сальмонеллы 80
3.4.1. Клеточный иммунный ответ при введении рекомбинантных штаммов сальмонелл 81
3.4.2 Гуморальный иммунный ответ 84
3.5. Изучение антигенных и иммуногенных свойств полиэпитопного белка TCI 89
3.5.1. Антигенные свойства белка ТСТ 91
3.5.2. Иммуногенные свойства белка ТСТ 91
3.5.2.1. Клеточный иммунный ответ 92
3.5.2.2. Исследование гуморального иммунного ответа 100
3.5.2.3. Вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных животных 102
Заключение 105
