Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Эндоцитоз в клетках млекопитающих 12
1.1.1. Фагоцитоз 12
1.1.2. Клатрин-зависимый эндоцитоз 13
1.1.2.1. Основные белки, участвующие в формировании клатриновой почки 15
1.1.2.2. Рекрутирование мембранных белков в клатрин покрытые районы 17
1.1.2.3. Отщепление клатрин покрытых пузырьков 17
1.1.2.4. Слияние и сортировка рецепторов в ранних эндосомах 18
1.1.3. Клатрин-независимый эндоцитоз 19
1.1.3.1. Липидные рафты 20
1.1.3.2. Кавеола 21
1.1.3.3. Функции кавеолина-1 23
1.1.3.4. Кавеосомы 25
1.1.4. Rab ГТФ-азы - регуляторы мембранного транспорта 26
1.1.4.1 ГТФ-азный цикл Rab белков 28
1.1.4.2. Эндосомальные Rab белки 30
1. 1.4.2.1. Rab5 - регулятор слияния эндосом 30
1.1.4.2.2. Rab7 и Rab9 в регуляции поздних эндосом 32
1.2. Проникновение вирусов в клетки 33
1.2.1. Клеточная мембрана и вирусные рецепторы 34
1.2.2 Клатрин-зависимый путь проникновения вирусов в клетку 37
1.2.3. Кавеола/рафт-зависимое проникновение вирусов 39
1.2.4. Макропиноцитоз 40
1.3. Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей 40
1.3.1. Классификация ВЭЛ 42
1.3.2. Структура вируса ВВЭЛ и его проникновение в клетку 44
1.3.3. Выход Альфавирусов из клетки 45
Заключение 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Материалы 48
2.2. Методы 49
2.2.1. Культура клеток 49
2.2.2.1 Ілазмидьі 49
2.2.2.1. Используемые плазмиды 49
2.2.2.2. Получение конструкций, экспрессирующих оболочечные белки ВВЭЛ штаммов Trinidad donkey и 3908
2.2.2.3. Получение конструкции, кодирующей оболочечный белок вируса Friend-57 ,. MLV, слитый с люциферазой
2.2.2.4. Получение лентивирусных экспрессионных векторов, кодирующих факторы эндоциТОЗНОІ о пути
2.2.2.5. Получение конструкций, кодирующих оболочечный белок VliLZV, слитый с
люциферазой 52
2.2.3. Производство пссвдотииированного MLV 52
2.2.4. Производство псевдотипированного лсптивируса 53
2.2.5. Повышение вирусного титра с помощью бутирата натрия 53
2.2.6. Определение вирусного титра 53
2.2.7. Нейтрализация вируса антителами 53
2.2.8. Использование ингибиторов эндосомального закислення 54
2.2.9. Метод количественного определения слияния вируса с клеткой 54
2.2.10. Определение кинетики слияния вируса с клеткой 55
2.2.11. Мечение вируса [ 5S] метнонином 55
2.2.12. Анализ экспрессии генов играющих роль в эндоцитозе
2.2.13. Удаление холестерина 56
2.2.14. Вертикальный электрофорез белков в гюлиакриламид ном геле в денатурирующих условиях 56
2.2.15. Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозиую мембрану 57
2.2.16. Иммунохимический анализ белков 57
2.2.17. Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Количественная оценка проникновения вируса в реальном времени 58
3.1.1. Неснецифическое включение фермента люциферазы в вироплазму 58
3.1.2. Специфическое включение люциферазы в вироплазму с помощью слияния с оболочечным белком "^
3.1.3. Сравнение целостности полученных вирусных частиц 62
3.1.4. Исследование специфичности полученных вирусных частиц на клетках, не содержащих вирусыый реїіентор
3.1.5. Исследование влияния Т471 Iі мутации на слияние вирусных частиц с клеткой... 65
3.1.6. Оценка эффекта ингибиторов в используемой модели слияния 66
3.2. Получение MLV векторов с ВВЭЛ оболочечными белками и их характеристика
3.2.1. Исследование экспрессии и включения оболочечных белков ВВЭЛ в вирусную частицу
3.2.2. Определение инфекционное полученных псевдотипов ВВЭЛ 74
3.2.4. Нейтрализация псевдотипов с помощью ВВЭЛ реактивной сыворотки 75
3.2.5. Ингибирование инфекции с помощью лизосомо і ройных агентов 77
3.2.6. Получение лентивирусных векторов с ВВЭЛ оболочечными белками 78
3.2.7. Определение диапазона клеток, инфицируемых исевдотипом 79
3.3 Слияние альфавирусов с клеточной мембраной gQ
3.3.1. Включение фермента люциферазы в ВВЭЛ псевдотип go
3.3.2. Определение целостности полученного вируса gj
3.3.3. Определение кинетики проникновения вируса 82
3.3.4 Исследование эффекта нейтрализующих антител на проникновение ВВЭЛ псевдотипа ^
3.3.5. Влияние ингибиторов зидосомального чакислепия на проникновение вируса g4
3.3.6. Экспрессия и FACS анали? белков, участвующих в эпдоциточе 85
3.3.7. Влияние Epsl5 ЕА95/295 на поглощение трансферрина и проникновение вируса, gg
3.3.8. Роль ранних и поздних эндосом в проникновении ВЭЛ gg
3.3.9. Зависимость проникновения нссвдотипа ВВЭЛ от холестерина g9
Заключение 91
Выводы 95
