Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Общие представления о протеазах и их роли в биологических процессах 9
2.1.1. Протеазы 9
2.1.2. Протеазы: функции в нормальных и патологических процессах 9
2.1.3 Про-протеинконвертазы: роль в нормальных и патологических процессах 10
2.2. Роль протеаз в вирусных заболеваниях 10
2.2.1. Механизм проникновения вирусов внутрь клеток 10
2.2.2. Вирус Лихорадки Западного Нила 11
2.2.3. Протеиназа NS3 - роль в жизненном цикле флавивирусов 12
2.3. Роль протсолиза в бактериальных инфекционных
заболеваниях 13
2.3.1. Бинарные бактериальные токсины 13
2.3.2. Токсины сибирской язвы 15
2.3.3. Связывание РА с клетками мешенями 16
2.3.4. Сборка токсина и эндоцитоз 16
2.3.5. Транслокация EF/LF 18
2.3.6. Ферментативная активность 20
2.4. Роль центросом и металлопротеиназы МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и туморогенезе 20
2.4.1. Матриксная металлопротеиназа мембранного типа МТ1-ММР 21
2.4.2, Центросома - органелла, отвечающая за генетическую стабильность 22
3. Материалы и методы 24
3.1. Реагенты 24
3.2. Антитела, белки и клеточные линии 24
3.3. Разделение цитоплазматической и ядерной фракций 26
3.4. Расщепление клеточного МЕК1 интернализованным LF 27
3.5. Определение цитотоксичности LF 27
3.6. Расщепление про-протеинконвертазами РА83 28
3.7. Интернализация биотин-меченых РА и LF 29
3.8. Иммунофлуоресцентная микроскопия 30
3.9. in silico моделирование 30
3.10. Клонирование генов и получение рекомбинантных плазмид 31
3.11. Экспрессия и очистка белков 31
3.12. Расщепление протеиназой NS3 белковых субстратов 33
3.13. Гидролиз пептидов протеиназой NS3 33
3.14. Определение протеолитической активности NS3 с помощью флюоресцентных пептидов 34
3.15. Мутагенез и трансфекция клеток 35
3.16. Получение рекомбинантного лентивирусного вектора и сборка вируса 36
3.17. Инфекция рекомбинантным лентивирусом линии клеток 184В5 и получение клонов 37
3.18. Определение хромосомной нестабильности 38
3.19. Модель рака молочной железы в иммунодефицитных (nude) мышах 39
4. Результаты 40
4.1. Активация и эндоцитоз летального токсина сибирской язвы 40
4.1.1. Расщепление РА83 про-протеинконвертазами 40
4.1.2. Эндоцитоз и расщепление РА 41
4.1.3. Расщепление Mekl интернализованным LF 43
4.1.4. Интернализация смешанных РА83-РА63 гептамеров мышиными макрофагами 45
4.1.5. Иммунофлуоресцентная микроскопия 47
4.2. Характеристика NS3 протеиназы из вируса Лихорадки
Западного Нила 48
4.2.1. NS3 расщепляет сайт фурина в белковых субстратах 48
4.2.2. Вероятные белки-мишени NS3 протеиназы в клетках хозяина 51
4.2.3. Серпины и пептиды на основе D-аргинина как ингибиторы NS3 55
4.3. Онкогенный эффект МТ1-ММР и гидролиз перицентрина 55
4.3.1. Анализ пептидов, содержащих сайт узнавания МТ1-ММР из перицентрина человека, собаки и мыши 55
4.3.2. Расщепление D948G мутанта мышиного перицентрина МТ1-ММР 58
4.3.3. Определение хромосомной нестабильности в эпителиальных клетках молочной железы человека 184В5 60
4.3.4. Модель рака молочной железы в иммунодефицитной (nude) мыши 61
5. Обсуждение результатов 63
5.1. Альтернативный механизм активации и эндоцитоза летального токсина сибирской язвы 63
5.2. Белковые субстраты и ингибиторы NS3 протеиназы из вируса Лихорадки Западного Нила 66
5.3. Роль МТ1-ММР в хромосомной нестабильности и онкогенезе 61
6. Выводы 72
7. Список литературы
