Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы: Пептаиболы как мембраноактивныс антимикробные пептиды 8
1 Мембраноактивные антимикробные пептиды 8
1.1 Спектр активности и специфичность действия АП 9
1.2 Структура АП и модели их мембранной активности . , 13
1.3 Структурно-функциональные зависимости на примере а-спиральных АП 19
1.4 Перспективы использования АП 23
2 Пептаиболы: структура, механизмы биосинтеза и биологическая активность 25
2.1 Структуры пептаиболов и их классификация . 27
2.2 Биосинтез пептаиболов... 30
2.3 Биологическая активность пептаиболов 32
2.3.1 Активность против бактерий и паразитов 32
2.3.2 Активность против грибов, роль в защите растений 33
2.3.3 Активность против клеток животных и митохондрий 34
2.3.4 Факторы, определяющие активность, связь с образованием каналов в модельных мембранах 35
2.4 Пространственная структура пептаиболов 36
2.4.1 Элементы вторичной структуры, встречающиеся в пептаиболах 36
2.4.2 Роль остатка Pro и другие структурные факторы, отвечающие за активность пептаиболов 38
2.4.3 Структура и динамика длинных пептаиболов: аламетицин, хрисоспермин и трихотоксин 40
2.4.4 Структура и динамика коротких пептаиболов: зервамицин, антиамебин, цефаибол, ампуллоспорин ихарзианин 42
2.4.5 Структуры пептаиболов в рамках BS модели 45
3 Взаимодействие пептаиболов с модельными мембранами 47
3.1 Структурные исследования взаимодействия пептаиболов с мембранами ...48
3.1.1 Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами ,.48
3.1.2 Положение спирали длинных пептаиболов относительно мембраны 49
3.1.3 Моделирование структуры аламетицина в мембране 51
3.1.4 Механизм перехода в ТМ состояние и наблюдение пор в мембранах 52
3.1.5 Влияние состава бислойной мембраны и трансмембранного потенциала...53
3.1.6 Структурные исследования взаимодействия коротких пептаиболов с модельными мембранами 55
3.2 Свойства каналов пептаиболов и модели их устройства 57
3.2.1 Потенциал-зависимая и потенциал-независимая проводимость пептаиболов в плоских мембранах : 57
3.2.2 Система уровней проводимости пептаиболов 59
3.2.3 Селективность каналов пептаиболов 63
3.2.4 Каналы пептаиболов в везикулах и целых клетках 65
3.2.5 Модели каналов пептаиболов 66
ЧАСТЬ II. Экспериментальные исследования ...69
4 Материалы и методы 69
4.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях 69
4.1.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов 69
4.1.2 Расчет пространственной структуры и энергетическая минимизация 70
4.2 Исследование 13С-15К-меченого Zrv-IIB в метаноле 71
4.2.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия, отнесение сигналов и определение степени включения меток .„. 71
4.2.2 Исследование взаимодействия пептида с растворителем и прямое наблюдение системы водородных связей 73
4.2.3 Уточнение пространственной структуры Zrv-IIB в метаноле 73
4.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле 74
4.3.1 Приготовление образцов и ЯМР-спектроскопия 74
4.3.2 Измерение расстояний: протон - спиновая метка 75
4.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 76
4.4.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов 76
4.4.2 Расчет пространственной структуры и определение положения пептида относительно поверхности мицеллы 77
4.5 Подготовка рисунков, депонирование экспериментальных данных и полученных структур 77
5 Результаты и обсуждения 79
5.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях 79
5.2 Исследование С- N-меченого Zrv-IIB в метаноле 82
5.2.1 ЯМР-характеризация С-13г4-меченого Zrv-IIB, определение степени включения изотопных меток и отнесение метальных групп остатков Aib 82
5.2.2 Прямое наблюдение системы водородных связей в |3С-15>7-меченом Zrv-IIB в метаноле 83
5.2.3 Сила водородных связей в спирали Zrv-IIB, связь с динамическим поведением пептида 85
5.2.4 Уточнение структуры Zrv-IIB в метаноле 86
5.2.5 Взаимодействие HN- и СО-групп основной цепи Zrv-IIB с растворителем. 87
5.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле 89
5.3.1 Межмолекулярные взаимодействия в Zrv-IIB и спин-меченых аналогах 89
5.3.2 Измерение расстояний: протон — спиновая метка в спин-меченых аналогах Zrv-IIB. 91
5.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 92
5.4.1 Стехиометрия комплекса Zrv-IIB/DPC мицелла 93
5.4.2 Структура Zrv-IIB в растворе DPC мицелл 93
5.4.3 Положение молекулы Zrv-IIB относительно поверхности мицеллы 94
5.5 Модель действия Zrv-IIB 95
5.5.1 Потенциал-зависимая активация каналов зервамицина 96
5.5.2 Ассиметрия вольтамперной характеристики Zrv-IIB 97
5.5.3 Потенциал-независимое поведение Zrv-IIB 97
5.5.4 Структура каналов зервамицина 98
5.5.5 Селективность каналов зервамицина 98
Заключение 99
Выводы 100
Благодарности 101
Использованная литература
