Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Система VEGF/VEGF-R 11
1.1.1. VEGF – фактор роста эндотелия сосудов .12
1.1.2. Общая характеристика VEGF-рецепторов (VEGF-R) .18
1.2. Рецептор фактора роста эндотелия сосудов 1 типа (VEGF-R1) 23
1.2.1.Молекулярное строение VEGF-R1 и его изоформы .23
1.2.2. Клеточная локализация и предполагаемые механизмы действия VEGF-R1 .25
1.2.3. Физиологические эффекты VEGF-R1 29
1.2.4. Роль VEGF-R1 при опухолевом росте 31
1.3. Заключение 35
Глава 2. Материалы и методы исследования .37
2.1. Линии клеток .37
2.2. Экспрессия гена VEGF-R1 (Flt1) 37
2.2.1. Обратная транскрипция (ревертирование) 37
2.2.2. Полуколичественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) 38
2.2.3. ПЦР в режиме реального времени (qPCR) 39
2.3. Оценка уровня и клеточной локализации белка VEGF-R1 .41
2.3.1. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток (ИЦХ) .41
2.3.2. Непрямая реакция иммунофлуоресценции на проточном цитометре с интактными и пермеабилизованными клетками (РИФ) 41
2.4. Исследование содержания VEGF-R1 в клеточном ядре .42
2.4.1. Выделение клеточных ядер 43
2.4.2. Цитологический анализ ядер 43
2.4.3. Мечение ядер антителами .44
2.4.4. Анализ ядер на проточном цитометре .44
2.4.5. Вестерн-блоттинг .46
2.5. Статистическая обработка результатов .47
Глава 3. Результаты и их обсуждение .48
3.1. Экспрессия гена VEGF-R1 (Flt1) 48
3.1.1. Полуколичественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) .48
3.1.2. ПЦР в режиме реального времени (qPCR) .49
3.2. Идентификация белка VEGF-R1 в опухолевых клетках человека .52
3.2.1. Локализация VEGF-R1 в опухолевых и нормальных клетках .52
3.2.2. Локализация VEGF-R1 в ядрах опухолевых и нормальных клеток .57
3.3. Количественная оценка содержания белка VEGF-R1 в опухолевых и нормальных клетках с помощью проточной цитометрии 62
3.3.1. Измерение VEGF-R1 на поверхности клеток .62
3.3.2. Измерение содержания внутриклеточной фракции VEGF-R1 .64
3.3.3. Анализ содержания белка VEGF-R1 в ядрах клеток 66
3.3.3.1. Контроль интактности и чистоты экстрагированных ядер 66
3.3.3.2. Количественная оценка содержания VEGR-R1 в ядрах 70
3.3.4. Определение белка VEGF-R1 методом вестерн-блоттинга .73
Заключение 76
Выводы .84
Список сокращений .85
Список литературы 86
