Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. Плазмиды и фаги 9
1.1. Основные свойства природных плазмид 9
1.2. Свойства бактериофагов 12
2. Векторы для клонирования в бактериях 14
2.1. Общие свойства векторов 15
2.2. Фаговые векторы 17
2.3. Векторы pUC 19
3. Свойства фазмиды N15 21
3.1. Свойства фазмиды N15 и структура ее генома 21
3.1.1. Лизогенная конверсия фазмиды N15 21
3.1.2. Физическая структура плазмидной и фаговой ДНК 22
3.1.3. Структура теломер и их образование 23
3.1.4. Генетическая организация плазмидного генома N15 27
3.1.5. Сравнение последовательностей протеломеразы и интеграз 31
3.2. Репликация линейной плазмиды N15 32
3.2.1. Модели репликации линейных ДНК 32
3.2.2. Механизмы образования теломер 34
3.2.3. Репликация фазмиды N15 36
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
1. Штаммы бактерий и бактериофагов 41
2. Плазмиды 41
3. Среды 41
4. Общие методы работы с бактериями и бактериофагами 45
5. Транспозонный мутагенез фазмиды N15сЗ 45
6. Транспозонный мутагенез фазмиды N15ts52 46
7. Транспозонный мутагенез мини-плазмиды ршВОб 46
8. Получение вариантов фазмиды N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу 47
9. Стабильность плазмидного состояния мутантов фазмиды N15 47
10. Определение частоты лизогенизации клеток 48
11. Выделение плазмидной ДНК 49
12. Трансформация клеток Е. coli 50
13. Рестрикционный анализ плазмид 51
14. Компьютерный анализ последовательностей 52
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ 55
1. Изучение свойств фазмиды N15 как лямбдоидного фага 55
1.1. Сравнительное изучение антигенной активности фазмиды N15 и
лямбдоидных фагов X и ф80 55
1.2. Получение рекомбинантов фазмиды N15 и лямбдоидного фагаф80 57
2. Изучение условно-летальных мутантов фазмиды N15,
дефектных по репликации 59
2.1. Частота образования Su" лизогенов ат-мутантами фага N15 59
2.2. Стабильность плазмидного состояния ts-мутантов фазмиды N15 при непермиссивной температуре 59
2.3. Урожай фаговых частиц условно-летальных мутантов фазмиды N15 на гесА" штаммах при пермиссивных условиях 61
2.4. Картирование условно-летальных мутаций по репликации 61
2.5. Компьютерный анализ продукта rep А гена фазмиды N15 63
3. Получение, характеристика и картирование инсерционных мутаций фазмиды N15 68
3.1. Транспозонный мутагенез фазмиды N15c3 69
3.2. Физическое картирование транспозонных мутаций 71
3.3. Транспозонный мутагенез температурочувствительного мутанта N15ts52 76
3.4. Получение вариантов фазмиды N15 с маркером устойчивости к хлорамфениколу 76
3.5. Транспозонный мутагенез линейной мини-плазмиды N15 78
3.6. Конструирование линейного плазмидного вектора 82
4. Изучение возможности увеличения размера генома N15 при
сохранении инфекционности фага 83
4.1. Получение варианта фазмиды N15, несущего два маркера устойчивости к антибиотикам 84
4.2. Оценка плотности упаковки генетического материала в фаговом капсиде 85
4.3. Получение и свойства рекомбинантной плазмиды N15Cml-pHind4 87
5. Получение свойства и картирование рекомбинантных линейных плазмид N15 с чужеродным репликоном 88
ОБСУЖДЕНИЕ 96
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 107
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 120
